流式细胞术在科研中的应用概要.pptVIP

流式细胞术在科研中 的应用 什么是流式细胞仪 流式细胞仪可检测到的细胞参数 外周全血细胞散射光双参数点图 荧光信号 流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。 几个概念： %Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。 Mean：平均荧光强度，与被检测物质的表达量有关，在正态分布时一般用该值。 Geo Mean：几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。 流式细胞仪数据分析 流式细胞仪数据分析 今天主要内容： 流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用 流式细胞术在肿瘤细胞DNA倍体中的应用 流式细胞仪的分选功能 流式细胞术在蛋白检测中的应用 1、半胱氨酸蛋白酶3检测法（早早期） 2、Annexin V-FITC/PI 法（早期） 3、Apo2.7检测法（早期） 4、TUNEL 法（晚期） 5、DNA含量分析法（晚晚期） 6、细胞凋亡相关蛋白的流式细胞术检测 DNA倍体的流式分析 细胞DNA含量检测 单参数直方图 DNA细胞周期分析 含量与凋亡关系 DNA亚G1峰的检测：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。 凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。 流式细胞仪的细胞分选功能 分选： 用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来， 用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般分选速度为每秒钟300个细胞， 大型机分选速度可达到每秒上万个细胞 总结 流式细胞术检测的是处于流动状态中的被荧光素标记的微粒，包括细胞、细菌或者微球。对于可溶性抗原，只能用相应的抗体先包被微球，再来结合抗原进行检测。 流式细胞仪器在临床和科研中具有广泛的用途。 Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04 Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 图 FCM测试细胞周 期分布和凋亡 488 nm laser + - Fluorescence Activated Cell Sorting Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 流式分选与分子生物学研究 除了将分选得到的细胞进行后续培养研究外，FCM分选系统可为PCR、FISH等分子技术提供纯度较高的特异性细胞群，减少研究中的干扰因素，获得更准确的实验结果。 Cytometric Beads Array (CBA)流式液相多重蛋白定量技术 导言 常规的蛋白分析方法： ELISA：一次反应只能检测一个指标 Western blot：不能对蛋白精确定量 不足之处： 检测多个指标需耗费大量样本 分批操作导致组间差异大 操作繁琐，耗时耗力 如何能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，获得高精确度的数据呢？ 针对于此，BD-Pharmingen成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多重蛋白定量技术——BD Cytometric Bead Array，简称CBA CBA技术简介 CBA是一系列带有不同强度红色荧光、包被有捕获抗体的微球，类似ELISA的捕获孔板，可以捕获液相样本（血清、血浆或者细胞培养上清液等）中相应的抗原，再结合PE标记检测抗体，形成双抗体夹心结构，通过流式细胞仪进行荧光检测，便可同时对样本中的多种可溶性蛋白成分进行定量 + + Analyte of interest Fluorescent detection Ab capture Bead capture Ab Bead BD Cytometric Bead Array 1 2 3 不同强度红色荧光的捕获微球，在FCM FL3检测 不同的目标蛋白 PE 标记的检测抗体，在FCM FL2检测。 PE的荧光强度即反映靶蛋白的含量 4 5 6 Human Th1/Th2 Lymphokine CBA Th1/Th2 panel: IL2, IL4, IL5, IL10, TN