第四章固定化技术技术分析.ppt

第一节 概述 第二节 固定化酶的制备 第三节 固定化酶的性质及其影响因素 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 固定化酶（细胞）的应用 第一节 概述 优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。 缺点：结合力弱，易解吸附。 ① 重氮法： 这是带芳香族氨基载体的主要反应，即载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基或氨基直接进行偶联。 ⑵ 肼解 ③ 溴化氰法： 带羟基的多糖类载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖等常用的反应。在碱性条件下载体羟基和溴化氰反应生成极活泼的亚氨基碳酸酯，它在弱碱中可直接和酶的氨基进行共价偶联反应。 ①严格控制反应条件，提高反应的专一性。 例如：使反应局限于α-氨基，保护ε-氨基； ② 应用可逆抑制剂或底物，封闭或牵制酶的活性中心与必需基团，避免试剂影响酶的活性构型和相应基团。 例如：在进行腺三磷酶(ATPase)固定化时，可先用对羟汞苯甲酸(PHMB)将酶的活性巯基保护起来，然后通过叠氮反应将酶偶联于羧甲基纤维素上，在完成固定化以后，再用还原剂使-SH活化，这样可得到高活性的固定化酶。 （二）细胞的固定化方法 基本概念 固定在载体上，并在一定空间范围内进行生命活动的细胞，称为固定化细胞。固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，故又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。微生物、植物和动物细胞都可制成固定化细胞。 1、吸附法 常用吸附剂：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。 是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。 一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。 (2) 吸附法固定化细胞的应用 a. 固定化微生物细胞：只用于生产各种能够分泌到细胞外的产物。 酵母细胞带有负电荷，在pH 3～5的条件下能够吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生产； b. 固定化植物细胞： 吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁。用于生产色素、香精，药物和酶等次级代谢物； c. 固定化动物细胞： 吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数属于附着细胞，必须依附在固体表面才能正常生长，故可吸附在容器壁，微载体和中空纤维外壁等载体上，制成固定化动物细胞，用于各种功能蛋白质的生产。 中空纤维由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纤维管壁是半透膜。 2、包埋法： (1) 基本概念：将细胞包埋于多孔载体内部而制成固定化细胞的方法，称为包埋法，包埋法能保持多酶系统，是目前制备固相细胞最常用的方法。 包埋法又分为凝胶包埋法和半透膜（胶囊）包埋法。 (2) 凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内，而使细胞固定化的方法，称为凝胶包埋法。 凝胶包埋法常用载体有：琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。 (3) 半透膜胶囊包埋法：将细胞分散于有机溶剂中成乳化液，此时，细胞被一层液态膜包围，形成具有半透膜胶囊的固相细胞。 2、微环境的影响 分配效应：由于载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物或其他效应物在微观环境和宏观体系间发生不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响了反应速度。 扩散限制效应是指底物或其他效应物的迁移和运转受到限制的—种效应。 （四）酶的最适pH 酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适PH的因素主要有两个。 (1) 载体性质对最适pH影响： 带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体 ：最适pH 向酸性偏移。 (2) 产物性质对最适pH影响； 反应产物为酸性：固定化酶最适pH比游离酶的最适pH要高。 反应产物为碱性：固定化酶最适pH比游离酶的最适PH要低。 若酶催化反应产物为中性时，固定化酶最适pH不变。 （五）底物特异性： 固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，一般为：作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化后专一性会发生变化。 如： 胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白质，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纤维素上的