第四章细胞融合及其应用技术分析.ppt

第四章 细胞融合及其应用 第一节 细胞融合概述 第二节 细胞融合技术应用 什么是细胞融合？ 为什么要进行细胞融合？ 简述细胞融合的研究历史。 一、细胞融合的概念和意义 1.概念 细胞融合（cell fusion) 又称体细胞杂交（somatic hybridization)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞或使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。 克服物种间杂交不亲和或不能受精或胚胎早期败育，为遗传物质广泛重组提供新途径。 如：薯番茄、番茄薯 1978年，德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣告，他用马铃薯与番茄相结合，得到了地上部分结青色果实的“薯番茄”，但地下尚未结出马铃薯的块茎。 后来，美国堪萨斯州立大学的科学家，把番茄和马铃薯的细胞部分融合在一起，培育出了地上结黄色果实、地下长白色薯块的“番茄薯”，据说番茄的产量很高。 创造细胞质杂种 为遗传学研究提供新的手段。 如：核质相互关系、基因作用与定位、肿瘤的发生等。 二、基本原理 细胞融合的基本原理是什么？ 简述细胞融合的大致过程。 1.相关概念： 合胞体(synkaryon)：在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞的细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的细胞结构称为合胞体。 同核体（homokaryon，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体。是由同源的原生质体融合产生的。 异核体（heterokaryon,异核融合细胞）：来自不同基因型的细胞融合形成的杂交细胞为异核体。由非同源的原生质体融合产生的。 杂种细胞（体细胞杂种）：来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞核内，产生出杂种细胞。由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞，因此又叫做体细胞杂种。 2.基本原理 3.细胞融合大致过程 三、细胞融合方法 细胞融合方法有哪些？试述其原理。 1.1植物或微生物原生质体的制备 1.2动物单个细胞的获得 首先获得动物组织，然后经消化液消化获得单细胞。常用消化液：胰蛋白酶适于细胞间质较少的软组织；胶原酶适于消化胶原和细胞间质丰富的纤维组织、癌组织等。   2. 融合方法 2.1.2 高钙-高pH法： 首先用于人和鼠的动物细胞杂交，后来引用在植物原生质体的融合，并利用这种融合方法获得了烟草体细胞杂种（1973年，50mmol/L钙离子、 pH值10.5）。 钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结合；高pH值能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。 该方法高pH值对原生质体有害。 异种融合效率达10-35%(高国楠,1974) PEG含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。 PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连; 在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合; 高Ca2+高pH清洗增加了质膜的流动性，大大提高了融合频率。 蟾蜍血细胞融合实验 仙台病毒：亦称HVJ（Hemagglutinating virus of Jap－an的缩写），乙型副流感病毒。属副黏液病毒属，RNA病毒。（M．Kuroya），（1953）。 １９５７年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并使膜产生一些断裂，两个细胞核会通过裂口融合在一起； 不耐热，几乎可凝集所有种类的红血球，而且有溶血性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖。 病毒囊膜上有许多刺突（spike)，刺突上都是一个单价血细胞凝集素； 刺突还有唾液酸苷酶的活性，水解寡糖链上的唾液酸残基，攻击细胞表面。 优点： 融合效率高，适合于各种动物细胞； 仙台病毒在鸡胚中大量繁殖，容易培养。 缺点: 仙台病毒不稳定，制备过程繁琐，易失活，容易对细胞产生干扰； 3.1植物细胞融合： 植物原生质体融合无种属特异性，融合效率只与外界条件有关。 PEG诱导关键是处理时间，过长损伤原生质体，过短不融合；PEG的规格和纯度，分子量多为4000－6000。 电融合，与原生质体密度有关，最适密度为2×104－8 × 104 电融合时，加入少量CaCl2,可维持电导率，保护细胞；交变电流强弱、处理时间长短及电脉冲的大小影响融合率。 添加促融合剂，可提高融合率。 3.2 动物细胞融合 亲本细胞表面性质影响大：表面覆盖绒毛且不规则的较容易；表面光滑的不易融合； 细胞种类不同，融合效果不同：腹水癌细胞易融合，淋巴细胞或血球细胞不易融合。