生物化学样品处理分析报告.ppt

第三讲 生物样品的处理 生物样品处理的主要问题 组成复杂，易变 样品量有限 分离纯化的步骤繁多 浓度变化范围宽 生物分子易失活 难评估 生物样品预处理的基本原则 步骤少、时间短，获得尽可能多的目标组分 通常包括以下考虑因素： 确定要处理的生物分子的目的和要求 掌握目标产物的物理、化学以及生物学性质 生物材料的破碎和预处理 分离纯化方案的选择和探索 评价生物分子纯度的检验方法 产物的浓缩、干燥和保存。 物理、化学及生物学性质的考虑 水溶液和各种有机溶剂中的溶解性 不同温度、pH值和各种缓冲液中的稳定性 对温度、含水量和冻干时的稳定性 分子的大小、带电的情况、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的扩散系数等 对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性等 对其他生物分子的特殊亲和力 组织及细胞内的定位分布等。 真核细胞的亚细胞器 细胞破碎的目的 使被分离的分子充分地释放到溶剂中，与细胞中其它化合物和生物大分子分离，并由固相转入液相，并尽可能保持原有的生物活性。 将目标分子从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中的过程。 水溶液提取 稀盐和缓冲溶液对蛋白质等生物大分子的稳定性好、溶解度大。考虑的影响因素如下： 盐浓度（即离子强度）：在低离子强度的溶液中绝大多数蛋白质和酶都有较大的溶解度，此为“盐溶”现象；中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。 pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值密切相关，一般提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内（pH 6～8），通常选择在偏离等电点的pH条件。例如胰蛋白酶为碱性蛋白质，常用稀酸提取。 （待续） 离心分离 利用离心作用将目标组分依据密度不同进行分离的技术 相对离心力，RCF（重力加速度的倍数）。离心半径10 cm，转速 40000 r/min时的RCF可达200000 g！ 沉降系数，Swedberg单位，单位离心力作用下的沉降速度 等密度离心法，用梯度溶液形成密度梯度，粒子或分子从离心管顶部进入与其等密度的位置时不受力；甚至可分离RNA和DNA。 用以收集细胞，细胞器，生物大分子等 分离条件温和，但是温度需要控制 生物样品的膜分离 透析 半透膜（纤维素 -大分子被截留，盐和小分子扩散通过 截留分子量指标 透析袋内为保留液，外为渗出液或者透析液 用于样品除盐、少量有机溶剂、生物小分子等;保留液体积经常增加（可达50%）。 超滤 加压膜分离技术，一定压力下小分子溶剂和溶质透过一定孔径的膜（乙酸纤维或硝酸纤维），而大分子不能通过 生物大分子的脱盐，脱水和浓缩 10-50% 例如 从血清/血浆中寻求生物标志物的关键是去除样品中占主导地位的高丰度蛋白质。血清/血浆样品中高丰度蛋白质： 白蛋白、转铁蛋白、结合珠蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G等六种蛋白质，占血清/血浆中蛋白质质量数的85%。 目前，从血清中除去高丰度蛋白质的方法主要有亲和柱色谱法和化学试剂除去法。 蛋白质的分步提取法（1998年Moloy等提出） 第一步，亲水性蛋白 用40 mmol/L Tris去离子水溶液反复冻融处理，加入适量的DNase I和RNase A 第二步，亲水性，中性和较疏水性的蛋白 提取液中含有表面活性剂CHAPS，还原剂DDT，裂解剂Urea等 第三步，疏水性蛋白 裂解液中添加能够促进疏水蛋白质溶解的表面活性剂SB3-10，还原剂DDT，裂解剂硫脲（thiourea）等。 常用蛋白酶抑制剂 除去影响双向电泳的污染物 核酸提取例-细菌培养液的DNA提取 培养液离心使细菌沉淀与试管底部；将沉淀分散在TE溶液（Tris-HCl EDTA，pH 8.0） 用SDS和蛋白酶K水浴37℃温育1小时进行细胞裂解 加入NaCl和CTAB水浴65℃温育20分钟去多糖等 加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混合液抽提；离心分离（核酸溶于上层的水相）；取水相加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提，离心分离取上清液 加入RNaseA 37℃温育30分钟分解去除RNA 温育后加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提，离心取上清液中加入无水乙醇，混合静置后得白色絮状沉淀 取絮状沉淀并在75%乙醇中清洗后风干，溶于TE溶液中4 ℃保存或者-80 ℃长期保存 UV吸收法测定纯度及浓度，凝胶电泳分离 RNA的处理过程中的降解问题 裂解液质量和用量 外源NRase的污染 组织裂解不充分 富含内源性酶的样品（脾脏，胸腺等）难以避免RNA的降解 在液氮条件下进行组织研碎 高效液相色谱（HPLC） 反相液相色谱（PRLC） 离子交换色谱 毛细管电色谱 分析处理的后期 主要指蛋白，核酸相对比较简单。 一般每次激光照射平均捕获3～5个细胞，每1