9132总大肠杆菌(滤膜技术)技术分析.docVIP

方法9 1 32 总大肠杆菌（滤膜技术） 1.0适用范围 1.1本方法用于测定废水和地下水中存在的一系列大肠杆菌类细菌1.2按本方法分析的大肠杆菌类细菌，包括所有能在24h培养期内产生具有金绿金属光泽的菌落的生物 2.0方法摘要 2.1将预定量的水样经滤膜过滤。水样中的细菌被保留在滤腆上 2.2分两步添加营养：先将保留有细菌的滤膜放在吸满月桂酰胰蛋白液态培养基的 吸收垫上，于35℃±0.5℃培养2h然后将滤膜转移到吸满M—Endo液态培养基的平皿 上。于35℃±0.5℃继续培养2l±lh在显微镜底下对带有光泽的菌落计数，按每100ml原水样报告计数结果 2.3在《水和废水标准检验法》和《环境监测的微生物学方法》二书（见本章参考文献）中，对本方法有更详细的介绍 3.0干扰 3.1存在余氯或其它卤素可妨碍细菌活动的持续.为防止出现这种问题，应加入硫 代硫酸钠 3.2水样中含有高浓度铜、锌或其它重金属可使细菌中毒只有在怀疑水样中存在重金属时才应加入赘合剂，例如四醋酸（EDTA） 3.3存在藻类或其它干扰物质会使水样混浊，致使试验的水样体积不足以获得有效的结果存在大量的非大肠杆菌类细菌或有毒物质会使大肠杆菌估计值偏低 3.4水样中含有大量悬浮固体会干扰茵落生长，还会干扰随后的滤膜上的汁 数遇有这种情况，应改用方法9131 4.0仪器和设备 4.1稀释瓶或试管 4.1.1使用耐热玻璃。最好是硼硅酸盐玻璃瓶或试管，其密封玻璃塞或螺帽应配带有在灭菌当中不会产生有毒或抑菌化合物的衬垫 4.1.2不可用棉塞作塞子在稀释瓶或试管壁上面，上擦不掉的刻度线可以尺寸适当的无毒塑料瓶代替玻璃瓶，但要保证这种瓶在灭菌时不会发生问题 4.2吸管和刻度量筒使用尺寸合适。能够准确、快速移取所需液量的吸管同一批产品的校准误差不得大于2.5%使用符合国家标准的刻度量筒 4.3培养基容器使用清洁的、预先灭过菌的硼硅酸盐玻璃烧瓶，以便减少细菌污染可以使用任何尺寸和形状的烧瓶。但最好是使用带金属帽、金属箔罩或螺帽的锥形烧瓶。以便充分混合培养基和便于贮存 4.4培养皿 4.4.1使用60×15mm，50x 12mm或其适当尺寸的培替氏培养皿培养皿底部必须平坦并足够大能够放平吸收培养养分用的吸收垫清洁的培养皿应先包好。再行灭菌；可以一个一包，也可以几个包在一起；干热灭菌时用金属箔包，高压灭菌时可用适当的纸代替如果使用玻璃培替氏培养皿。应使用硼硅酸盐玻璃或同等质量玻璃的.由于这种培养皿的盖是松配合的，因此要采取措施防止培养基因蒸发损失而使其浓度改变，同时要保持环境湿润以利于菌落生长 4.4.2只供一次性使用的紧配合塑料培养皿只要符合上述技术指标，也可以使用 4.5过滤装置 4.5.1过滤组件（用玻璃的、经得起蒸压灭菌的塑料、瓷料或任何其它不会腐蚀的、细菌学上惰性的金属做成）包括一个无接缝的漏斗以及紧固漏斗用的锁定装置，也可以利用磁力或重力安放漏斗在设计上，要考虑到滤膜要能可靠地安放在漏斗承受部分的多板上，不致受到机械损伤，并且所有液体在过滤时都能透过滤膜。 4.5.2将这套过滤装置的两个部件分别用厚纸包好，蒸压灭菌后贮存备用也可以不包封而直接用紫外线照射处理后再用在野外使用的装置可以点燃甲醇来灭菌，也可以浸入沸水中煮5min不要点火燃着塑料部件 4.5.3过滤时。将过滤组件的承受部分安放在1L的滤瓶上，滤瓶带支管或其它适用的装置，便于在滤膜上施加压差.将滤瓶与电力真空泵、水压过滤泵、手动抽气器或其它能产生压差的装置连接。在滤瓶和真空源之间再接上一个瓶子，用以收集逸出的水 4.6滤膜 4.6.1使用适当孔径（.45±0.02μm）的滤膜，以便完全截留大肠杆菌类细菌使用的滤膜必须由生产厂家进行过完善的质量控制试验并有合格证这些滤膜应能完全截留准备培养的生物，使用中稳定，不含对细菌生长和发育不利的可萃取化学物质，过滤速度令人满意，对培养基的pH无明显影响。不会使融合菌落或蔓延菌落的数目增加所使用的滤膜上标记的格线。最好既不会抑制，也不会刺激细菌生长滤膜应贮存在温度和湿度适的环境中每买一批滤膜，数量不宜超过一年所需 4.6.2如果准备使用经过生产厂家灭菌的滤膜，厂家必须证明灭菌过程既未诱导出毒性。又未改变滤膜的化学或物理性质.如果滤膜是在实验室里灭菌，则要先从成叠的滤中取掉滤膜之间的隔纸，但不要取出吸收纸垫把滤膜分成10～12张（或其它方便的张数）一叠，放直径10cm的培养皿中。或者用厚包装纸包好，于121℃蒸压灭菌110min一到，迅速放出蒸汽，以尽量减少滤膜上凝聚的水分 4.7吸收垫 4.7.1吸收垫由盘状滤纸或其它材料做成，这些材料必须质地优良。不含亚硫酸盐或其它能抑制细菌生长的物质吸收垫直径约为48m，并要有足够的厚度，能吸收1.8～2.2m培养基经过灭菌的商品