IPTG诱导蛋白表达全面技术分析.docxVIP

IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点 摘要 :?异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG 常用于需要诱导 β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止 β-半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。 中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG) 英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside 用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG 常用于需要诱导 β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在 HYPERLINK /zt/disease/219828.html \t _blank 大肠杆菌中的表达。IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止 β-半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。 使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。当 HYPERLINK /zhuanti/product/201308/443731.html \t _blank dna片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。  HYPERLINK /zhuanti/product/201308/442101.html \t _blank 配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器 HYPERLINK /zhuanti/product/201308/441188.html \t _blank 过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。 优点： 1.能诱导酶的合成，但又不被分解的 HYPERLINK /zhuanti/product/201308/441914.html \t _blank 分子，称为安慰诱导物。由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。 2.IPTG不被菌体代谢，为乳糖类似物，一旦进入 HYPERLINK /zhuanti/product/201308/441821.html \t _blank 细胞就会产生持续长久的诱导效果，所以IPTG的诱导效率高，往往只需要很少量(1mmol/L)即可达到理想诱导效果。由于IPTG不被代谢，在胞内专一诱导外源蛋白的表达。不受细胞代谢的影响，诱导效果持续稳定。乳糖有双效作用，既能做为诱导剂异乳糖的前体物质，又可以做碳源，在诱导过程中，很不稳定，IPTG因其优异的稳定性决定了它适合做实验研究用。 3.IPTG能在缺乏lacY HYPERLINK /reseach/gene/ \t _blank 基因下而有效地被抄送。 4.半乳糖苷键中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为β–半乳糖苷酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。 注意事项：培养噬菌体时，Top agar中的添加量为：25 μl/3 ml(24 mg/ml)。含有 IPTG 的培养基4℃避光保存，须在1~2 周内使用。 保存：2-8°C冷藏保存，配制好后保存于-20°C，室温可放置一个月。远离热源及氧化剂。 IPTG诱导蛋白表达的原理.材料.实验方法 摘要 :?E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控 E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三