细胞课程设计解决方案.doc

目 录 一、设计目的和要求 1 （一）. 设计目的 1 （二）. 设计要求 1 二、总体方案的拟定 2 （一）. 实验原理 2 （二）. 技术路线 3 三、原料选取说明 4 四、实验仪器的确定 4 五、实验试剂的选择及制备方法 5 六、实验过程设计 6 （一）. 实验步骤 6 （二）. 操作要点 7 （三）. 注意事项 7 七、设计心得 8 八、参考资料 9 一、设计目的和要求 . 设计目的 步掌握和熟练动物细胞培养的基本内容，了解细胞培养的特点和步骤。 . 设计要求通过设计实验，掌握细胞，用消化法进行小肝细胞的培养实验通过选取和培养基配方以及，掌握实验设计技能；基本掌握、培养中形态发生和建成的途径；掌握培养中对温度、、等各种条件的要求与技术。 在本设计性实验项目过程中，掌握快速查阅专业文献资料的能力，根据培养目的选定合适的材料，拟定培养方法，设计培养基配方；掌握无菌操作方法，找到防止污染的措施及污染原因的分析；培养在实验过程中发现问题、分析问题、解决问题的能力；培养团队协作及与实验指导教师交流、合作的能力；为从事生物细胞学领域的相关研究及与细胞工程有关的生物技术奠定良好的技术基础和实验能力。二、总体方案的拟定 . 实验原理 原理（二）. 技术 实验准备阶段 清洗：新玻璃器皿用自来水刷洗，再侵泡5%HCL中和碱性物质和其他有害物质，使用过的玻璃器皿,侵入清水中避免干涸难洗，用洗涤剂清洗，倒置干燥，侵酸性洗液过夜，捞出用自来水清洗，烘干，用纸包装。高压蒸汽灭菌，储存备用。胶塞处理：用清水清洗，再用0.2%NaOH煮沸10—20min,自来水清洗10次，用1%Hcl侵泡30min，自来水清洗10次，蒸馏水刷洗3次晾干，高压灭菌。旧的胶塞直接用洗涤剂煮沸清洗，晾干，包装，高压灭菌。 消毒：物理消毒1）紫外线消毒：用于消毒空气，操作台和不能用干湿热灭菌的培养器皿。2）干热灭菌：用于玻璃器皿的灭菌，将用器皿放在干燥箱加热至160c,保温90-120min 3）湿热灭菌：高压蒸汽灭菌，是最有效的灭菌方法，用于布类，橡胶制品，金属器械，玻璃器皿，某些塑料制品及加热后不产生沉淀的无机溶液。4滤过除菌：用于培养液和各种不能高压蒸汽灭菌的溶液，采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上合适的滤膜。化学消毒：1）70%或75%酒精，用于一些金属器械，台面的消毒 2）0.1%新洁尔灭：主要用于手和前臂及台面的消毒。3）来苏尔水：用于无菌室桌椅，墙壁，地面的消毒。4）0.5%过氧乙酸：10min可将芽孢杀死，用于物品的表面消毒，用喷洒和擦拭的方法。 注意事项： 清洗玻璃制品时，侵酸之后一定要用清水冲洗10-15次，残留液体对细胞粘附有极大影响，清洗塑料制品时用棉花或揉软纱布，千万不要用硬毛刷，以免损坏表面。试管用超声清洗处理后逐个清洗，没有洗净会有影响。 干热灭菌，应在白天用烘箱，避免发生意外，当温度超过100c时不能打开烘箱门。金属制品，橡胶，塑料制品不用此法。 高压蒸汽灭菌后，器皿务必晾干，烘干，以免发霉 牛血清，大部分培养基，胰酶和一些生物制剂是有机溶剂，不用高压蒸汽法灭 过滤灭菌时，过滤器使用前包好过滤膜，高压灭菌后才可使用，过滤酶制剂时将温度降到室温下，压力不宜过大，过大会使过滤膜破裂，过滤膜包装时，螺丝不宜过紧，以防蒸汽不能进入，灭菌后拧紧使用。 化学消毒时，配制75%酒精用卫生级，来苏尔水不能消毒皮肤 四、实验仪器的确定 超净工作台、CO保温箱、显微镜、水浴箱、离心机、离心管高压灭菌锅、电热干燥箱、酒精灯、纱布、解剖剪、解剖镊、培养瓶、培养皿、研磨玻片、滤网、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器五、实验试剂的选择及制备方法 1.75%乙醇99.7%*V=75%*100) 2. RPIM1640培养液（小牛血清和青霉素、链霉素） 1) 配制培养基最好使用新制备的三蒸水。一般在试验前当天或前一天制备为好。调节pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。 2) 制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌）。 3) 溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。 4) 补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。 5) 加抗生素：一般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。市售青霉素为80万U／瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加0.5ml即可。市售链霉素为100万U／瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加0.5ml即可。无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为50～200U/ml。 6