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遗传物质的复制 南通大学江苏省神经再生重点实验室 蒋茂荣 DNA的半保留复制 一、DNA复制采用的是半保留复制方式 　半保留复制（Semiconservative Replication） DNA复制是分别以亲代螺旋双链中的一条为模板合成其互补链，由此产生的两条子代双螺旋都是由一条亲代链和一条新合成链组成，因此称做半保留复制。 半保留复制的实验证实 　　 Meselson和Stahl密度标记实验 复制起点、方向和速度 复制子（replicon）:基因组中 DNA分子复制的单位，其中包含一个起始复制的复制起点。细菌染色体、质粒、噬菌体和其它病毒只有一个复制起点，因此整个DNA分子就构成一个复制子，而真核生物染色体有多个的起始点，因此含有几个复制子 复制起点（origin） 　染色体中DNA分子开始复制的特定位置就是复制起点； 　复制起点的特征：复制原点通常富含A/T碱基对，回文序列和重复序列也是复制起点常见的DNA结构；复制起点中的顺式DNA序列通过与特异的反式作用蛋白质因子反应激活复制起点； 　许多原核生物的复制起点有比较固定的碱基顺序和结构，不同物种间保守性较高 半不连续复制(semidiscontinuous replication) 半不连续复制 DNA合成的一种模式。以两条亲本链为模板合成子代链时，一条子链的合成是连续的，另一条是不连续的。 先导链(leading strand) 、后滞链(lagging strand) 与冈崎片段(Okazaki fragment) 以两条亲本链为模板合成子链时，一条子链可沿自身5‘→3’方向持续合成，即前导链；而另一条子链的合成是不连续的，即后滞链。在后滞链的形成过程中，首先以亲本链为模板按照自身5’→3’方向合成出许多1kb-2kb的短的不连续片段，这些片段被称做冈崎片段，然后这些短片段共价联结成一条完整的后滞链，后滞链的成长方向与其片段的合成方向相反 参与复制的酶和蛋白质因子 复制体(replisome) 担负DNA合成工作的多聚蛋白结构，在细菌复制叉处装配。包括了DNA聚合酶和其它酶类。 DNA复制酶(DNA replisase) 具有确定的DNA复制合成功能的酶。 构成复制体的几种主要酶类及蛋白质因子 DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA连接酶(DNA ligase) 单链结合蛋白(single strand binding protein, SSB) DNA解旋酶(DNA helicase) DNA拓扑异构酶(topoisomerase) DNA引发酶(DNA primase) RNaseH 目 录 　PCR的概念 　PCR技术的创建 　PCR的原理 　PCR的反应体系和方法 　PCR的类型和应用 目 录 　PCR的概念 　PCR技术的创建 　PCR的原理 　PCR的反应体系和方法 　PCR的类型和应用 目 录 　PCR的概念 　PCR技术的创建 　PCR的原理 　PCR的反应体系和方法 　PCR的类型和应用 引物设计网址： /cgi-bin/ primer/primer3_www.cgi 引物设计软件 Primer 5 目 录 　PCR的概念 　PCR技术的创建 　PCR的原理 　PCR的反应体系和方法 　PCR的类型和应用 10×PCR buffer 5μl dNTPmix(2mmol/L) 4μl 引物1（10pmol/L） 2μl 引物2（10pmol/L） 2μl DNA模板（50ng-1μg/μl） 1μl Taq 酶（2U/μl） 1μl 加双蒸水至总体积为100μl 注意事项 目 录 　PCR的概念 　PCR技术的创建 　PCR的原理 　PCR的反应体系和方法 　PCR的类型和应用 相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图 2 ）高度的特异性 引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 引物设计： （1) 序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-30bp为宜。上下游长度差别3bp （3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60% 。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基,尽可能为G/C；5’端无严格限制，可加入限制性酶切位点。 （7）解链温