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（Real Time PCR） Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR 实验方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 应用实例 Real Time PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 ( C-代表Cycle，t-代表threshold） SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 TaqMan探针为一寡核苷酸， 5’端标记一个报告基团(Reporter)， 3’端标记一个淬灭基团(Quencher)。 Cycling probe为一寡核苷酸，5’端标记一个荧光报告基团(Reporter)，3’端标记一个荧光淬灭基团(Quencher)，寡核苷酸为DNA/RNA杂合体。 SYBR Green I 法 ◆优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异性探针。 ◆缺点：引物要求高（要求特异性扩增）、不能进行多重PCR。 Probe法 ◆优点：特异性强，能进行多重PCR。 ◆缺点：需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难。 各公司Real Time PCR检测系统比较 Real Time RT-PCR反应 反转录反应 标准曲线分析 融解曲线分析 绝对定量和相对定量解析方法 标准品梯度的选择：5～6个梯度 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10 基线平整 Negative control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽 相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。 标准曲线分析 融解曲线分析 绝对定量和相对定量解析方法 Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。 标准曲线分析 融解曲线分析 绝对定量和相对定量解析方法 通过标准曲线对对照样品、检测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。 检测方法 Cycling Probe法 SNP 位点 ALDH2 type1和ALDH2 type2 (G/A) 使用试剂 Cycleave PCR Core Kit TaKaRa Code.CY501 使用仪器 Smart Cycler Ⅱ 体外转录的Internal control RNA电泳照片 检测方法 SYBR Green I荧光嵌合法 管家基因 GAPDH基因 目的基因 X基因 标 准 品 体外转录RNA 试 剂 SYBR? ExScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time） TaKaRa Code No.DRR053 仪 器 Line-Gene33 相对表达量计算 相对值= 校正值= 目的基因定量结果 管家基因定量结果 检测样品的校正值 对照样品的校正值 4.874 0.2618 1946.1 7432.9 RNA样品3 0.037 0.0020 17.3 8589.7 RNA样品2 1.000 0.0537 343.4 6391.5 RNA样品1 相对量 校正值 定量结果 定量结果 目的基因X 管家基因H 检测样品 相对定量解析顺序 Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR 实验方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 应用实例 主要内容 定性分析 对人的ALDH2基因进行SNP解析。 绝对定量 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量分析。 相对定量 分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化。 Real Time PCR 应用实例 实验背景 Aldehyde dehydrogenase-2（ALDH2）基因位于人类第12对染色体q24位置，有ALDH2 type1和ALDH2 type2两种基因型，其两种基因型序列的差别在exon12第487个氨基酸位置，ALDH2 type1型为Glu(GAA), ALDH2 type2型为Lys(AAA)。 定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析 热变性 酶切 延伸 退火 Cycling Probe法基本原理 野生型（wild homo）为ROX标记，突变型（mutant homo）为FAM标记。 RNase H分解 PCR扩增产物 PCR扩增产物 PCR扩增产物 杂合探针 杂合探针 杂合探针 PC