分子生物学技术在诊断水产养殖传染病中的应用.docVIP

分子生物学技术在诊断水产养殖传染病中的应用 我国是水产养殖大国，水产养殖业在国民经济中占有重要地位。近二十年来，由于生态环境的恶化，我国水产养殖业，尤其是贝类及虾类养殖业受到传染病严重影响。这种传染病最初往往以流行病出现，随后发展成为地方流行病，最终造成毁灭性的后果。因此，如何快速准确预报和诊断水产动物的疾病，成为水产养殖发展计划或经营部门十分重要而突出的问题。　　为了达到预报目的，必须建立一种可快速诊断所有各种病原体的技术方法，使之既适用于实验室的条件，也可为水产养殖现场所采用。过去，主要采用光学显微镜组织化学流行病学的调查方法。由于其制作过程繁杂，标本观察耗时，因而难于广泛应用。另外，光学显微镜术不能定量地确定动物感染程度，对病毒的感染也无法诊断。近年来，由于现代生物技术和分子生物学的迅速发展，已经有可能为贝、虾类病原体检测和诊断提供一种快速有效而且特异性和灵敏度高的技术手段。本文介绍在免疫学方面及以核酸杂交为基础的技术方法及原理，并分析它们应用于贝、虾类等水产养殖方面的优缺点。一、免疫学方法　　兔疫学方法是利用特异性抗原抗体反应。观察和研究组织细胞特定抗原(或抗体)的定位和定量技术。为了显示和观察这种抗原抗体反应，需要预先将某种标记物结合到抗体上，借标记物的荧光或酶的有色反应、放射性或高电子密度，在光镜或电镜进行定性、定位或定量研究。在水产养殖方面，可用这种技术作为检测贝类和虾类病原体手段。　　1、免疫试剂　　由于无脊椎动物缺乏免疫球蛋白介导的免疫应答，要对感染进行免疫诊断，只能根据抗体对病原体的特异反应。因此，抗体是任何免疫检测手段最重要的组分。所选用的标准抗体试剂必须具有一定的特异性和灵敏度，才能对检测结果进行正确的分析和解释。　　(1)多克隆抗体(polyclonal antibodies)　　多克隆抗体就是传统的抗体制备的一抗血清，即以特定抗原兔疫动物后取其血清作为抗体。长期以来，多克隆抗体由于制备容易，可与高纯度的抗原进行免疫反应，已经广泛用于细菌检测。贝类和虾类多数的病原体是胞内原生动物、立克次氏体（rickettsia）及病毒。由于海洋无脊椎动物还没有建立细胞系，这些病原体不能在体外产生。制备免疫所需要的抗原，只能依靠分离和纯化这些胞内病原体。现在，已经有几种有效制备高特异性抗体的纯化手段。　　多克隆抗体由于含有多种抗体成分，因而会产生个体免疫应答。在一批血清之间，经常可观察到一些重要的变异性。此外，多克隆抗血清产生普遍性的免疫应答，它们含有一个可与许多不同免疫原决定簇，特别与污染的宿主抗原起反应的抗体群。产生这种非希望的交叉反应会造成假阳性诊断，因而妨碍免疫检测的实际应用。实践中利用以下几种方法，提高多克隆抗血清的特异性。　　①稀释高滴定度抗血清，以消除低水平的交叉反应，保留特异反应。　　②用宿主抗原吸收抗血清，以除去交叉反应的抗体。　　以上措施可提供合适的特异性。多克隆抗血清特别适合于检测那些变异的潜在变异的病原体，其不同抗原决定簇可被异质性的抗体识别。对于间接免疫荧光检测，多克隆抗体是种很好的免疫试剂，但对于酶联兔疫吸附检测(enzymed-linked immunosorbent assay)就不合适。　　(2)单克隆抗体　　在需要大量特异性相似的免疫试剂的情况下，单克隆抗体是很有用的。　　Kohler和M lStein(1975，1976)创造了产生单克隆抗体小鼠杂交瘤(hybridoma)的方法，为制造和使用抗体开创了一个新纪元。杂交细胞系的无隆化选择和长期生长，保证了其抗体产物的单克隆性、高特异性和永久产生的特性。其基本原理是:脾脏的B淋巴细胞能产生特定的抗体，它是一种终末分化的浆细胞，在体外培养中很难存在，而骨髓瘤(myeloma)细胞在体外可以连续传代培养，长期存活。因此，将此两细胞融合，可获得具有瘤细胞无限繁殖的特点和B淋巴细胞产生针对某抗原决定簇的抗体功能的杂交瘤(hybridoma)细胞系，杂交瘤经筛选，将B淋巴细胞杂交瘤单个分离，长成分泌特异性抗体的细胞克隆。杂交瘤可以冷冻或贮存在液氮或一70。C之中，然后复苏，保证不断产生单一的抗体。　　单克隆抗体这些潜在的优点，使它们作为免疫试剂在海洋无脊椎动物病理学诊断中应用，具有很大的吸引力。早先诊断平牡蛎Ostrea edulis中一种血细胞内寄生原生动物(Bonamia ostreae)，就是应用单克隆抗体技术成功例子。另外，这种技术也应用于诊断港湾扇贝Pecten maximus的鳃立克次氏体，与鱼类及牡蛎相结合的淋巴细胞病毒(Lymphocystivitius)及菲律宾蛤仔（Tapes philippinatum）棕环病病因弧菌P1(Vibrio P1)。　　2、免疫学检测　　(1)间接免疫荧光检测