包含体纯化步骤.docVIP

同样采用Ni-NTA His结合树脂亲和纯化重组目的蛋白，离心收集菌体，并用1×BS缓冲液洗涤两次将保存的菌体沉淀用总体积为mL的1×Mm NaH2PO4; 10mM imidazote,pH8.0)重悬，至溶液呈白色澄清4℃ 12,000 rpm离心0分钟，用包涵体洗涤Buffer (50mmol/L Tris-HCl100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5% Triton x-100，pH8.0)洗涤沉淀两次包涵体溶解Buffer（50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0）充分溶解，4℃10,000 r/min离心30min，收集上清pET-32a(+)载体表达的蛋白C﹑N端融合了6个组氨酸的tag，可用金属螯和层析纯化，也可用抗6个组氨酸的单克隆抗体检测表达蛋白的正确性。根据表达蛋白的溶解情况分两种方法对蛋白进行纯化。目的蛋白的表达和收获：用.2.2.1所述的方法大量表达目的蛋白。4℃下10,000 rpm离心5 min弃上清，向细菌沉淀中加入4℃用冰预冷的1×Ni-NTA结合缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑, pH8.0)，每100 mL培养液加入4 mL结合缓冲液，重悬菌体。40℃冷冻，室温溶解，反复冻融三次。再在冰水浴中超声10 min(超声10 s, 间隔10 s)，破碎菌体。4℃下10,000 rpm离心20 min，保留上清液。 Ni-NTA His·Bind resin的准备：将树脂充分重悬，取4 mL悬液(每2mL树脂悬液可吸附510 mg蛋白)加到10 mL柱(gravity column)中，树脂自然沉降后，加1×Ni-NTA结合缓冲液洗两次。 目的蛋白的吸附和洗脱：将菌体上清液加到处理好的树脂中，4℃轻柔混匀，结合2h。树脂自然沉降后，打开柱下端的管帽，让缓冲液缓慢流出。液体流完后，加1×Ni-NTA漂洗缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑，pH8.0) 5mL，轻柔混匀，漂洗两遍。结合、漂洗过程中收集上清100 μL，以备电泳分析。然后加1×Ni-NTA洗脱缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, pH8.0咪唑浓度分别为100、2、、、1000 mmol/L)，按照咪唑浓度由低向高洗脱并收集目的蛋白，每0.5 mL收集一管。SDS电泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液包涵体的纯化：收集的菌体按每100 mL培养基所得菌体加入20 mL 1×变性结合缓冲液(0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl, pH8.0, 不含尿素) 冰浴30 min按前述方法进行超声，重悬菌体。5,000×g离心15 min，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。移去上清，将沉淀重悬于20 mL 1×变性结合缓冲液，重复上述步骤。移去上清，按每100 mL培养基加5 mL缓冲液的比例，加入含8 mol尿素的1×变性结合缓冲液重悬沉淀。冰浴孵育1 h彻底溶解包涵体。16,000×g离心30 min去除不溶成分。 Ni-NTA His·Bind resin的准备、目的蛋白的吸附和洗脱方法同前。1×变性漂洗缓冲液(8 mol尿素，0.1 mol/L NaH2PO4, 0.01 mol/L Tris-ClpH6.3)漂洗两遍后，加入pH5.9的1×变性洗脱液(8 mol尿素，0.1 mol/L NaH2PO4, 0.01 mol/L Tris-Cl) 0.5mL洗两遍，再用pH4.5的1×变性洗脱液洗脱并收集目的蛋白，每0.5 mL收集一管。结合、漂洗过程中收集上清100 μL，以备电泳分析。SDS电泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液。将变性条件下纯化的目的蛋白的收集液进行SDS电泳，切胶回收。－20℃保存胶条。所有胶条放于研钵中，加入适量0.7%的生理盐水，研磨成很细的颗粒状，用mL的针头可以吸入。电泳检测，估计蛋白浓度。2.3免疫印迹检测鳜MT-2在各组织内的分布 实验用鳜，体重为400 g左右，免疫前驯养一周。用于免疫印迹的器官包括鳃、肝脏、心脏、肾脏、肌肉、头肾、脑、脾脏和肠道。将所取的组织分别在MEB缓冲液（100 mmol/L β-磷酸甘油，20 mmol/L HEPES，20 mmol/L EGTA，15 mmol/L MgCl2，pH 7.3，临用前加入1 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF，2.5 μg/mL leupetin，2.5 μg/mL aprotinin）中匀浆，-40 ℃冻存。临用前将组织匀浆液14,