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包涵体复性 包涵体复性  i$ ^2 @ L/ r, E声明：0 G5 X) [+ ~( l* ]0 f0 R1、 本篇涉及的资源主要源于网络及相关书籍，由酷友搜集、分析、整理、审改，供大家学习参考用，如有转载、传播请注明源于基因酷及本篇的工作人员；若本篇侵犯了您的版权或有任何不妥，请Email genecool@126.com告知。7 _$ w! q0 s. s7 F. `- U Z# g2、 由于我们的学识、经验有限，本篇难免会存在一些错误及缺陷，敬请不吝赐教：请到基因酷论坛（/bbs）本篇对应的专题跟贴指出或Email genecool@126.com。4 j1 Q# a Y Q# j. V致谢：8 i m: A( r# n n y5 r整理者：phyllis? ? 审改者：nano??db+ ]- x5 y1 n; v/ M主要参考资料：蛋白技术手册0 s* g- q! Y) T- R- X. I8 Z M. ~本篇主要内容：$ H$ m: S8 b( H1.原理1 A/ i w0 m! o: U8 X, m- ~2.形成原因和减少策略. H ?2 c- Z0 q6 v3.方法$ x8 l9 H# v: M% ]4.效率和检测??N??t* \9 x G7 j9 f6 h??l7 f5.注意事项2 D* B* S$ Q _. U: Y9 r6.常见问题分析8 g( s; d3 g- Y??n 包涵体复性原理 包涵体复性原理 0 N4 T# j7 o??\4 z j　　包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。 包涵体形成原因及减少策略 包涵体形成原因及减少策略 9 r) q; U??Q7 I$ P! C: {形成原因1 g5 r4 S; n Q1 d??I1. 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。9 s H$ D* D% f- @??^2. 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。$ G/ B+ L Z+ m% E3. 重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。5 ~- ? q. G! o5 S( O: t$ m, g! `4. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。% [5 Y4 E% [9 e+ I5. 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。5 }8 y: P c% V }7 p. Q x??B减少包涵体形成的策略4 e4 [8 H/ L0 q u+ Z# j1. 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。 3 o* l8 u* z7 N# q: {2. 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇? ? 类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。% k+ T/ T4 m d$ }) `9 F* I- N; k3. 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。 包涵体复性的方法 包涵体复性的方法 6 z. Z7 [* }! d* g4 D% B% B　　一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。+ g# P# M3 a. M*