利用pcr技术检测活细胞中生长素的含量-湖南农业大学.docVIP

湖南省大学生创新性实验计划项目申报表 项目名称 利用PCR技术检测活细胞中生长素的含量 起止时间 2012年3月至 2015年5月 申请经费 1.0万 申请人（团队） 姓名 年级 所在院系、专业 项目分工 联系电话 肖湲 2011 生科院 生物技术 阴性细胞筛选和诱导及GFP表达检测 李冰 2010 生科院 生物工程 原生质体分离和IAA测定 导 师 姓名 黄志刚 学位 博士 职务/职称 副教授 E-mail dochzg@126.com 电话 立项依据（包括自身具备的知识条件生长素（IAA）是最早发现的植物激素，在调节植物从胚胎发生到成熟的生长进程中起着决定性作用。随着研究的深入，发现其作用具有明显的时空特异性，细胞间细微的生长素浓度差异足以引起发育方向的彻底改变，如决定干细胞的维持与分化或器官原基的发生。同时，在生长素与其他信号途径之间，存在着复杂的互作网络。因此，探索生长素在组织和细胞水平的原位实时测定新技术，对于深入阐明生长素介导的生长发育过程以及调控机制十分必要和迫切。 DR5是受生长素特异诱导的启动子，通过与报告基因融合表达，结合激光共聚焦显微镜观察，能够灵敏且直观地反映组织和细胞水平的生长素活性强弱。尽管目前尚未实现准确定量，但由于DR5所反映的是具有生物学功能的活性生长素，因而有望成为在探索生长素细胞水平的原位定量测定方面进行方法创新的重要工具。转化了DR5::GFP的拟南芥根组织为材料，通过原生质体分离制备悬浮原生质体；用流式细胞仪分别将已被IAA诱导（GFP阳性）和未被IAA诱导（GFP阴性）细胞的原生质体进行分型收集；将GFP阴性原生质体在IAA梯度浓度的不同缓冲液中进行悬浮培养孵育，以获得相应IAA浓度的原生质体；待DR5::GFP稳定表达后，GFP mRNA表达水平GFP mRNA表达准确量关系应用DR5启动子对IAA进行定量原位测定。① 关于生长素及其作用机理 生长素的发现可以追溯到10多年前Darwin的向光性试验。上世纪30年代分离鉴定出IAA并证实其具有促进生长与生根的作用，其在维持顶端优势中的作用存在极性运输不同组织敏感性等也陆续得到确认。在随后很长一段时期，尽管在生长素的生物合成和生长素结合蛋白（ABPs）等方面有不少进展，但IAA信号转导途径的研究进展较慢。关于IAA受体的研究直到2005年才取得突破，TIR1和AFBs等先后被鉴定为IAA受体。在生长素极性运输机制方面，分别确定了多个IAA外运蛋白（PINs）和IAA内运蛋白（AUX1/LAX），通过将上述生长素运输蛋白基因与GUS和GFP等报告基因融合，先后揭示了IAA在茎尖和根尖等部位的流动情况。随着IAA作用分子机理研究的深入，发现胚的发育、顶端分生组织的形成以及叶与根的发生等诸多发育过程都受生长素流的控制，而生长素流又受另一些因素的控制。因此，更深入的作用机制研究对于植物组织或细胞、甚至亚细胞水平的IAA精确原位检测提出了迫切要求。 ② 关于生长素特异性诱导的基因与启动子 植物中一些基因受植物激素的诱导，已发现受IAA诱导的基因主要有Aux/IAAs、SAURs、GH3s和PLTs等几种，从上述基因中鉴定出一些受生长素特异性诱导的启动子，如D1、D2、P3、ER7和DR5等。其中，由基本序列TGTCTC以一定间隔多次重复而成的DR5是生物活性最强的启动子之一。除上述仅受IAA诱导的启动子外，还发现有同时受生长素和细胞分裂素诱导的Pg5启动子。近年来，通过与报告基因融合，DR5等高活性生长素特异性诱导启动子被广泛应用于研究IAA相关突变体的遗传筛选、植物组织和细胞对IAA的响应以及IAA诱导基因的表达与定位。由于其特异性和高生物活性，DR5启动子展现出在细胞水平对生长素进行定量原位测定的应用潜力，但如何根据报告基因表达情况（如mRNA、报告基因产物表达量等）与细胞中IAA含量之间建立准确的数量关系，。 ③ 关于生长素的定性与定量检测 生物试法主要利用植物激素的生理活性，通过器官组织对植物激素产生的特异性反应来进行测定至今常被用于植物激素的定性鉴定。光谱法除主要用结构鉴定外，也被用作定量测定 长期以来，ELISA和RIA等免疫分析技术一度成为植物激素测定的经典方法并取得了新的进展。胶体金免疫技术或免疫探针技术结合电镜分析可进一步植物激素进行定位。近年对毛细管电泳和化学发光等新方法在IAA测定中的应用进行了探索，但目前已实现的灵敏度一般在μg级，离实际应用于植物学研究还有一定差距。基于高分辨质谱和聚类分析的代谢组学方法也开始应用于IAA测定，同时测定游离态IAA、结合态IAA、IAA衍生物并解析其与其他植物激素间的相互作用。此外