大鼠脂肪间充干细胞培养-杭州赫贝.docxVIP

赫贝公司总部地址:?杭州市文一西路1378号杭州师范大学科技园F楼7层电话：0571 大鼠脂肪间充质干细胞原代培养及R基因瞬转实验 1材料与方法 1.1材料 DMEM-H培养基：GIBCO公司。胎牛血清FBS：GIBCO公司。 I型胶原酶：SIGMA公司。 Opti-MEM培养基：GIBCO公司。 Lipofectamine2000TransfectionReagent：GIBCO公司。胰酶：GIBCO公司。 100×青-链霉素(100×P.S.)：GIBCO公司。RunX2：分子室提供。其余试剂均为国产分析纯。 1.2仪器 二氧化碳培养箱：3111型，Thermo公司。倒置显微镜：DMIL型，Leica公司。 台式低速离心机：80-2型，上海医疗器械（集团）有限公司。细胞培养瓶：Corning公司。 细胞培养板：Corning公司。微量加样器：Thermo公司。 纯水仪：Millipore公司 1.3方法 1.3．1原代培养 无菌条件下剪取SD大鼠双侧腹股沟脂肪垫，冷PBS漂洗三遍，剪碎，加入适量 0.075%I 型胶原酶，在37℃条件下震荡消化约50min。100目筛网过滤消化悬液，用等量含有10%FBS的DMEM培养基终止消化，1500rpm，10min。弃上清，收集细胞沉淀，以10%FBS的DMEM培养基调整细胞浓度为105/ml,接种于T25培养瓶中。37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。每3d换液一次。至贴壁细胞长满瓶底后，0.25%胰酶消化传代， 1:2接种于T25培养瓶中，记录传代次数并拍照。 1.3.2瞬转 取P3至P4代对数生长期大鼠脂肪间充质干细胞，0.25%胰酶消化，离心收集沉淀，以Opti-MEM培养基轻轻吹打混匀细胞，细胞计数，以2*105/孔的细胞量接种于6孔板，待细胞贴壁。依照Lipofectamine2000转染说明书，对R质粒进行转染操作，设两个空白对照孔。转染后6h换正常DMEM培养基，孵育48h。细胞送交分子室QPCR验证。 另取P3至P4代对数生长期大鼠脂肪间充质干细胞，接种于T25培养瓶中，重复上述转染操作。细胞送交分子室WB验证及相关蛋白检测。 2实验结果 2.1细胞图片 2.1.1P1代细胞图片 2.1.2P3代细胞图片 2.1.3P4代细胞图片 2.1.4P8代细胞图片 2.1.5细胞瞬转图片 Ctrl组（CK） 转染试剂对照组（Lipofectamine2000） 转染组（RunX2） 2.2QPCR和WB结果 详见见分子室实验报告。 3小结 3.1初代细胞（P1） 原代大鼠脂肪间充质干细胞培养1-3d，贴别后可见多数细胞成圆形或不规则形，散在少量梭形细胞，类似成纤维细胞，培养5d后细胞呈团簇状生长，形成集落，细胞融合超过90%。 3.2细胞传代（P2-P8） 0.25%胰酶消化细胞，约3min后细胞开始皱缩，此时用含10%FBS的DMEM培养基终止消化，吹打约30次，细胞全部脱落。细胞1:2传代后2-4h开始贴壁，经较短的潜伏期后开始增殖，3d即可长满。传至2-3代后，细胞形状逐步规则，成梭形。 传至7-8代后，细胞增殖速度逐步变慢，部分细胞漂浮，细胞贴别变慢，出现大量 多角形细胞和细胞碎片，显示细胞出现衰老征象。 3.3细胞转染 取P3和P4代细胞进行瞬转实验，设置CK组（正常培养），Lipofectamine2000 对照组（只加入Lipofectamine2000）和RunX2转染组（加入Lipofectamine2000和RunX2 质粒）。QPCR验证瞬转结果显示，RunX2转染组RunX2基因较两个对照组高表达约 300倍，瞬转实验成功。 但是，由瞬转细胞图片可见，R转染组较两个对照组，细胞受到损伤；而Lipofectamine2000对照组细胞较CK组无明显变化，细胞生长状态良好，故排除转染试剂Lipofectamine2000自身细胞毒性对细胞状态的影响。综上，推测R基因高表达后会对大鼠脂肪间充质干细胞造成一定损伤。