重组质粒的构建与转化重点.docVIP

实验目的 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 掌握利用Cacl2 制备感受态细胞的方法。 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。 学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。 实验原理： （一）限制性核酸内切酶的酶切反应 体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分