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项目3：革兰染色法 【目的要求】】 染色方法有单染法和复染法。前者应用一种染料使细菌着色，用以观察细菌的大小、形态和排列；后者用两种或两种以上的染料，有助于鉴别细菌，故又称鉴别细菌染色法。革兰染色法为最常用的染色法。 一、细菌涂片的制作 要进行细菌染色，首先需制作细菌涂片，制片的一般过程分涂片、干燥和固定三个步骤。 【材 料】 【方 法】 1 2．干燥：涂片置室温自然干燥，也可在酒精灯弱火处略烘使干，切勿用高温烘烤。 3．固定：将干燥的涂片面向上在酒精灯火焰上来回通过三次，直至手背试触涂片反面略有烫感为限。固定的目的是杀死细菌并使菌体与玻片粘附较牢，以免染色时被染料和水冲掉。 二、革兰（Gram）染色法 革兰氏染色法(Gram’s stain)是最常用的细菌染色法，本实验要求同学能正确掌握此染色方法的操作技术，理解其在鉴别细菌上的重要意义。 【原理】 G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌（G—）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。 【材料】 24h斜面培养物 ② 大肠埃希菌24h肉汤培养物 ③ 革兰氏染色液：结晶紫染液、碘液、95％酒精、稀释石炭酸复红液 ④ 生理盐水 ⑤ 载物玻片、接种环、显微镜、镜油、擦镜纸等。 【方法】 按涂片→干燥→固定→染色→镜检的顺序进行。准备载物玻片：用镊子从载物片缸中取出经3％盐酸酒精脱脂的载物玻片，用擦片布擦净，然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.5~2.0cm的圆圈，做为涂膜的标记范围。 点燃煤气灯：先把煤气灯的煤气孔和通气孔闭上，再把管道的煤气开关打开，然后把煤气灯的煤气口稍稍开放，立即用火柴点燃之，适当调节煤气孔和通气孔，使火焰长度在8~10cm，并能分清内外焰为止。 1．涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下： 用肉汤培养物涂片： ① 右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。 ② 将接种环按15°角放在酒精灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝烧红(图1—2)，然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。 ③ 用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将试管口用火焰烧灼灭菌。 ④ 用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料(图1—3)，此时注意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。 ⑤ 将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上略加烧灼（时间要短以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。 ⑥ 将接种环上之材料涂于载物片上，随后立即将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。 用斜面培养物涂片： 用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。无菌操作取材步骤同前。 2．干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。 3．固定：用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。 4．染色： ①将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1min。 ②水洗后加卢戈氏碘液处理(媒染)1min。 ③水洗后用95％酒精脱色，脱色时频频摇动玻片，直至流下的液体无色为止(约需0.5min)。 ④水洗后加石炭酸复红稀释液染色(复染)0.5min。 ⑤水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检。 染色过程中，水洗要用自来水的细流徐徐冲洗，冲洗涂膜的背面，勿使强水流直接冲到涂膜上。 【结果观察】 (染成紫色)，哪种细菌是革兰氏阴性菌(染成红色)。 将在标本中观察到的细菌形态和染色性，用有色铅笔画出模式图，并附以文字说明。 注意事项：①酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。②被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在18~24h之内。 【实验报告】 1．记录细