聚合酶链式反应和琼脂糖凝胶电泳实验重点分析.docVIP

实验三 聚合酶链式反应（PCR）以及琼脂糖凝胶电泳 实验目的 1.掌握PCR反应的原理及各反应成分的作用； 2.熟悉PCR反应程序的设计规则； 3.掌握引物的设计原则及其与PCR其他成分的配制方法； 4.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理及其应用范围； 5.熟悉琼脂糖凝胶电泳相关缓冲液的配制方法。 实验原理 一．聚合酶链式反应原理 在已知待扩增模板全部或部分序列的情况下，依据DNA半保留复制的机理，在含有Mg2+的缓冲溶液中，采用耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在特异性引物（分为上游和下游引物）的引导下，通过dNTP为原料，以cDNA或DNA等为模板，在人为控制DNA合成系统（PCR仪）温度调节下，通过变性（95℃）、退火（50-60℃ ）及延伸（ 72℃ ）等3个步骤的循环进行（30-35循环），在体外进行双链DNA变性为单链，单链DNA与特异性引物退火形成局部双链，进而在DNA聚合酶的作用下使引物沿相应模板延伸为特异性引物所限定范围的大量双链DNA的体外合成反应。 本质为体外DNA合成的酶反应。 琼脂糖凝胶电泳反应原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。在一定电场强度下偏碱性的缓冲液中（TAE pH8.0或TBE pH7.5-7.8），DNA分子带负电，其迁移速度取决于分子筛效应，在电荷效应与分子筛效应作用下，具有不同的相对分子量及构