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医学分子生物学（补充知识点） 第一到四章（答案见重点） 1）细胞DNA克隆的主要步骤。 2）载体的一般特性以及常用载体的种类和特点。 3）PCR的基本原理、特点以及应用。 4）DHPLC分析DNA变异的原理。 5）染色质免疫沉淀技术(ChlP)的基本原理及应用。 6）miRNA的概念、作用机制及研究策略是什么。 7）在制备转基因动物时，影响转基因表达的因素有哪些？ 8)蛋白质表达的检测方法有哪几种？各自的主要应用是什么？ 9）亚硫酸氢盐处理DNA后，进行DNA甲基化检测的基本原理是什么？相关检测方法有哪些？ 概念：基因组DNA文库 、实时荧光定量PCR、ＲＮＡ干扰、基因打靶、表观遗传学、蛋白质组学、报告基因 概念：1，实时荧光定量PCR：指在PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程,进而对起始模板进行定量分析的方法。 2，ＲＮＡ干扰:是一种由双链RNA（dsRNA）始动的序列特异性基因沉默机制。 3，基因打靶:是利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源序列发生同源重组的性质, 以定点修饰改造染色体上某一基因的方法。 4，表观遗传学：研究有丝分裂和/或减数分裂可遗传的基因功能改变，而不涉及DNA序列的改变。 5，蛋白质组学：蛋白质组学是指从整体角度分析细胞或组织内蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态等。在相关的样品间比较细胞中所有蛋白质的表达，鉴定差异表达的蛋白质，称表达蛋白质组学。 6，报告基因：是一种编码易被检测的蛋白质或酶的基因。报告基因检测是真核生物基因表达调控研究的常用方法 论述题 1）细胞DNA克隆的主要步骤。 2）载体的一般特性以及常用载体的种类和特点 质粒 λ噬菌体：高效感染细菌的病毒；DNA分子为线性双链5′末端是12个核苷酸突出的粘性末端，又称cos序列。进入宿主细胞后，COS序列碱基配对环化。 ①置换λ载体:外源DNA片段取代λ噬菌体DNA分子中间部分的基因。插入9-23kb,常用于制备基因组DNA文库 ②插入λ载体:外源DNA片段插入λ基因组的CI基因.插入片段：〈10kb 常用于制备cDNA文库 粘粒：将质粒和λ噬菌体改建的载体，改造后含λ噬菌体的COS序列以及质粒（plasmid）特性:携带外源DNA分子约30-45kb。 P1噬菌体和P1衍生人工染色体（PAC）：P1噬菌体:其DNA为线性，体外包装于蛋白质壳内。P1DNA进入宿主细胞后环化，扩增。携带外源DNA片段约100kb 将P1噬菌体和F因子结合构成了PAC，携带外源DNA片段约130-150kb。 细菌人工染色体：是基于大肠杆菌的F因子构建的、低拷贝的质粒载体。（F因子是大肠杆菌中自然存在的一种致育质粒，编码多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质）。它不同于一般质粒，能携带外源DNA片段300kb 酵母人工染色体：YAC的结构特征1）着丝粒：有丝分裂姊妹染色单体分离之必需。2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶侵袭。3）自主复制序列（ARS）元件：染色体自主复制的起点。与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。携带外源DNA片段：0.2-2Mb 3）PCR的基本原理、特点以及应用 PCR特点 快速：PCR一个周期仅为3-5分钟，经过 30个周期约几个小时，可得到足量的目的DNA用于分析 灵敏：PCR能够扩增少量目的DNA，甚至单个细胞DNA，有助于极少量标本的研究；如法医学物证、分子病理学、产前基因诊断等。适用样品广泛：有时标本是混杂物，难以分离DNA或DNA部分降解，如化石标本、福尔马林固定的标本等。 PCR局限性①产物片段短小：一般小于5kb②一定的错配率: 高保真Taq酶可大大降低错配率；它适合对PCR保真性要求较高的实验，如基因筛选、测序、突变检测等③产量有限：单一PCR反应中克隆的DNA量有限，且有时不适合某些后续研究。 可利用细胞克隆体系来克隆PCR产物。获得大量的目的DNA进行各种分析。 PCR应用非常广泛：各种生命现象的生理、病理机制的研究；疾病诊断；法医学； 考古学等。 DHPLC分析DNA变异的原理。 5）染色质免疫沉淀技术(ChlP)的基本原理及应用。 6）miRNA的概念、作用机制及研究策略是什么。 microRNA(miRNA,即微小RNA)是一类内源性的、长约21～25个核苷酸的小分子非编码RNA，对基因表达具有重要的调控作用。 作用机制：1） miRNA与靶 mRNA不完全互补，主要影响翻译过程而对mRNA的稳定性无影响。2）若二者完全互补，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA；或通过使mRNA去poly A尾，使其稳定性降低而降解。 研究策略：1、表达检测：Northern Blot； Real time PCR ； miRNA芯片；深度测序等检测表达