gus基因检测介绍.doc

gus基因PCR反应程序： 94℃预变性5 min 94℃变性1 min 58℃退火1 min 30个循环 72℃延伸2min 72℃延伸7 min gus基因引物序列为：5’GCTATACGCCTTTGAAGCC 3’和5’TTGACTGCCTCTTCGCTGTA 3’ GUS 染液:500mg/L X-Gluc, 0.1mol/L K3Fe CN 6，0.lmol/L K4Fe CN 6，0.0lmol/L，Na2-EDTA, 1% Triton X-100 V/V , 0.14mol/L PBS 缓冲液 pH7.0 。 试剂名称 母液浓度 配置方法 工作液浓度 工作液配置方法 mL X-Gluc, l0mg/mL 20mg X-Gluc溶于2ml DMSO 500mg/L 50 K3Fe CN 6， 1 mol/L 32.9424g—100ml水 0.1mol/L 100 K4Fe CN 6 1mol/L 42.239g—100ml水 0.lmol/L 100 Na2-EDTA 0.5mol/L 18.61g—100ml水 调pH为8 0.0lmol/L 200 Triton X-100 10% 取10ml Triton X-100 用水定容至100ml 1% 10 PBS 缓冲液 10×0.01 mol/L 0.1mol/L 250 1000mL 0.5M Na2HPO4配制方法：将17.907g Na2HPO4溶于水，定容至100ml。.5M NaH2PO4的配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml 这是1ml的配方体系：终浓度 药品 分子量 体积 0.5M Na2EDTA 20ul TritonX-100 1ul 1M 磷酸钠缓冲液（PH7.0）? ?100ul 0.1M K3Fe CN 6 5ul 0.1M K4Fe CN 6 5ul 10mg/ml X-Gulc 200ul 去离子水或无菌水 669ul 染液配方 0.05M磷酸缓冲液 4.48ml??5mM铁氰化钾0.05ml, 5mM亚铁氰化钾0.05ml，Triton-100 0.01ml，水4.64ml，X-Gluc先溶于0.05ml DMF中，终浓度为0.5mg/ml37度染色过夜 1 ?? 染色：加入适量配制好的GUS 染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS染液中，将24孔板置于37保温箱中放置6h。 2 ?? 漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。 3 ?? 脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。 4 ?? 记录：在体视显微镜下拍照记录。 2．GUS GUS 能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。MU的激发波长为365nm，发射波长为456，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。 2.1 1 ?? 1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。 2 ?? 1mol/L NaH2PO4 溶液：15.601g NaH2PO4 溶于100ml水。 3 ?? 0.1M 磷酸缓冲液 PH7.0 ：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。 4 ?? 10％ SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。 5 ?? 0.5 M EDTA PH8.0 ：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。 6 ?? GUS酶提取液：0.1M 磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml； 0.5M EDTA PH8.0 取2ml； Triton X-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。 7 ?? MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。