森林冬虫草：水溶性虫草多糖研究重点分析.doc

森林冬虫草：水溶性虫草多糖研究 虫草多糖由于其抗肿瘤作用、抗辐射作用和免疫调节作用，对人和动物无毒无害，对治疗肿瘤和感染所引起的免疫抑制有巨大的价值贡献。但迄今为止，所发现的虫草多糖多为胞内多糖，即是胞外多糖也是水不溶性的，增大了人体吸收的难度。因此，寻找生产免疫活性的水溶性胞外多糖的虫草新种，探讨生产虫草多糖和菌丝体的最佳条件就显得非常迫切和需要。本文对川藏森林冬虫草所含虫草多糖（CDP）的免疫调节作用，组成及液体培养条件进行了研究。 　　研究结果表明：森林冬虫草所含虫草多糖CDP为水溶性胞外多糖，不像其它人工培植虫草虫草胞外多糖不溶于水而致人体难以吸收。草原冬虫草含有两种虫草胞内多糖CT-4N和CS-1，其产率为别为0.08%和0.77%。而森林冬虫草的水溶性虫草多糖CDP粗糖产量为16.75g/l，纯多糖产量也较高可达13.5g/l，明显高于上述几种多糖。实验中还论证了森林冬虫草所含虫草多糖CDP的具有免疫作用。 　　首次发现森林冬虫草含有在虫草中稀见的脂溶性抗生素。因此脂溶性抗生素和CDP可望得到综合利用。 　　森林冬虫草的服用安全性也得到论证。 　　下面为实验过程和方法： 　　【1】材料和方法 　　1.1菌种提取自川藏森林野生冬虫草。 　　1.2?培养基 　　1.2.1沙氏培养液（Sabouraud‘s Broth）:葡萄糖40g，蛋白胨10g，水1000ml。 　　1.2.2马铃薯葡萄糖培养液（PDA）:取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1L，煮30分钟，纱布过滤，滤液中加葡萄糖20g，最终体积至1000ml。 　　1.2.3察氏培养液（CZ）:蔗糖30g，NaNO33g，K2HPO41g，MgSO4.7 H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO40.01g，蒸馏水1000ml。 　　1.2.4AM培养液：可溶性淀粉20g，葡萄糖20g，棉子粉4g，蛋白胨4g，土豆粉4g，MgSO4.7 H2O0.4g，CaCO34g，蒸馏水1000ml，pH6.0。 　　1.2.5黄豆粉葡萄糖培养液（SGM）：葡萄糖30g，黄豆粉5g，酵母膏2g，K2HPO41g，MgSO4.7 H2O0.5g，蒸馏水1000ml。 　　1.2.6完全培养液（CM）:葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母膏5g，蒸馏水1000ml。 　　1.3方法 　　1.3.1淋巴细胞转化实验：参阅林学颜（1980）方法。 　　1.3.2菌丝产量测定：按俞大绂等（1985）方法。 　　1.3.3多糖的提取：参阅李兆兰（1987）方法。 　　1.3.4粗多糖重量的测定：取烘干恒重的粗多糖粉末放在电光分析天平上称重。 　　1.3.5粗多糖纯度的测定：采用蒽酮—硫酸法。具体操作参阅张惟杰（1987）的方法。 　　1.3.6纸层析：用新华1滤纸（24×10cm），乙酸乙酯-吡啶-水（10:4:3）为展开剂（吴梧桐等，1984）。显色剂为苯胺-磷酸试剂，4g二苯胺，4ml苯胺及20ml85%磷酸溶于20ml丙酮（张惟杰1987）标注品与样品含量均为10mg/ml左右。 　　1.3.7培养方法 　　静置培养：25℃恒温培养24天。200ml三角瓶100ml培养液，接种量5ml。100ml三角瓶装20ml培养液，接种量0.5ml。 　　振荡培养：24~26℃，振床转速100~110r/min200ml三角瓶装去100ml，接种量5ml，4个重复。与多糖有关的实验中，7~8个重复，多糖是7~8瓶所含的多糖之和，折合成每升培养液所产生多糖的量。生物量取4个最接近的数值平均值。 　　数据处理：仪器为CASIOfx-3600p函数计算器。采用LSR法。 　　【2】实验结果 　　2.1森林冬虫草水溶性胞外多糖（CDP）对淋巴细胞转化的影响 　　本试验所用森林冬虫草水溶性胞外多糖（CDP）粗品用SGM培养液生产，纯度为80%。CDP转化率比对照增加16.2倍，说明CDP有促进淋巴细胞转化作用，但与PHA合用无协同作用。该种情况在用银耳子实体多糖（TF）所做的淋巴细胞转化实验中也出现，说明不是偶然现象。 　　2.2森林冬虫草水溶性胞外多糖（CDP）的分离纯化及组成单糖的鉴定。 　　取森林冬虫草水溶性胞外多糖（CDP）粗品干粉3g,溶于30ml热水中，离心除去不溶物，用Sevag方法除蛋白，干燥备用。取0.1g脱蛋白多糖，经Sephadex G-200柱（2×60cm）分离，洗脱液为0.1M NaCl,流速为0.25ml/min，分管收集，每管3ml，蒽酮法检测。洗脱曲线见图1,由此图可知仅有一个峰，说明CDP只有一个组分，利用分子排阻法推测其分子量200,000左右。 　　合并含糖量高的洗脱液25ml透析至无Cl-为止，然后用PEG6000浓缩至1ml，加入5ml2N硫酸，封安瓿8