原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
实时定量PCR实验故障排除
扩增曲线原始数据Spectra：各波长的原始信号
没有标准曲线 没有标准曲线 没有扩增曲线 原始数据只有1个循环Spectra?只有1个循环的数据原因： 1.收集数据的步骤只有一个循环，只收集了一个数据点 2.电脑为了节省电源而休眠，通讯中断，1个循环后的数据丢失原因1：PCR参数设置错误 原因2：硬盘休眠
从原始数据找原因从第1-第9个循环，ROX的信号升高并逐渐下降。在所设定的4-13基线范围内，ROX信号值是变化的，而FAM的信号值基本上是固定的，经过FAM/ROX的校正后，比值自然不相等，所以基线不是水平的直线，而有下滑部分。 ROX的信号变化与所用试剂的质量有关。应该取10-20为合理的基线范围。
解决方法 修改基线范围为10-20，重新分析。 重新分析的结果 基线范围取10-20，重新分析后的图谱。 第1-9循环的信号为负数，由于试剂质量引起。 增曲线分成两段扩增曲线断裂
?原因：基线的终点大于CT值，通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值 15，而基线仍然取3-15，其中包含部分扩增信号，导致标准偏差偏大，阈值过高解决方法：减小基线终点，至CT值前4个循环，重新分析数据样品浓度跨度太大 直线扩增曲线 原因：探针部分降解 V形扩增曲线V形扩增曲线 V形扩增曲线 扩增微弱或者信号很弱 ROX信号不稳定
扩增曲线不光滑 原因：信号太弱 解决方法 ?使用高质量的探针 ?补救方法： 1.7000的SDS软件升级到v1.12.关闭ROX校正，重新分析数据 关闭ROX校正的效果 ROX帮助故障诊断(1) 现象：重复性很差
正常的原始数据 原因：盖子未盖紧，溶液蒸发 排除蒸发的数据后 ROX帮助故障诊断(2) 现象：山坡形扩增曲线 原始数据显示有蒸发 引物二聚体SYBR Green I?化学，Dissociation curve试验 ?推荐措施：提高引物设计质量， 避免形成引物二聚体 ?补救措施：优化引物浓度和退火温度 ?也许：专设80度步骤收集信号？
文档评论（0）