实验四超氧化物歧化酶测定重点分析.docVIP

高级植物生理实验报告 植物抗性生理 农学院 农药学 东保柱2013202054 2013年12月27日 实验1 超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛含量的测定 （操作步骤） 1 试剂配制 1.1 磷酸缓冲液 (PBS) 配制 药品名称 称 量 ( g ) 母 液 取母液量 ( ml ) 配 成 磷 酸 缓 冲 液 (PBS) ml mol/L 合并配成 稀释1倍 NaH2PO4 1.20 100 0.1 85 1000 ml 0.10 mol/L pH 7.8 2000 ml 0.05 mol/L pH 7.8 Na2HPO4 14.20 1000 0.1 915 注：配成PBS2000ml，其中1000ml用于A液配制，另1000ml用于酶液制备。 1.2 其它溶液配制 代 号 溶液名称 配制浓度 称取药品量( g ) 稀释或定容 配成量/每样品用量(ml/ml) 用于 A 蛋氨酸 (Met) 缓冲液 15 mmol/L Met 2.2383 加1000ml pH7.8, 0.1mol/LPBS 1000 / 2 SOD活性测定 B 乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液 0.003 mmol/L EDTA 0.0877 (1)100ml 热蒸馏水 (2) 再稀释1000倍 1000 / 0.1 SOD活性测定 C 核黄素(VB2) 溶液 0.1 mmol/L VB2 0.0038 100 ml 蒸馏水 100 / 0.1 SOD活性测定 D 蓝四氮唑 (NBT)溶液 0.1 mmol/L NBT 0.0818 1000 ml 蒸馏水 1000 / 2 SOD活性测定 E 三氯乙酸 (TCA) 溶液 10 % TCA 100 1000 ml 蒸馏水 1000 (用于液的配制) 丙二醛(MDA)含量测定 F 硫代巴比妥酸 （TBA）溶液 0.5 % TBA 5 1000ml 10%的 液 1000 / 2 丙二醛(MDA)含量测定 2 称取植物材料１g，加少许0.05mol/L、pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中研磨，最终定容制得10 ml匀浆。转移至10ml离心试管中，在3000 rpm下粗离心１分钟，粗提液再转移至2个5ml离心管中，在冷冻离心机13000g、４℃下离心20分钟，上清液即为酶液，用于SOD活性和丙二醛含量的测定。 3 丙二醛含量测定 吸取酶液２ml→加入Ｆ液２ml→沸水浴加热15分钟(呈粉红色)→快速冷却→4000rpm 下离心５分钟。若以种子为材料，则加热后溶液混浊，需增加离心力。以Ｆ液为参比液，分别在532nm 和600nm处测定光密度值。 丙二醛含量（nmol·g-1）＝ 式中：V/v --- 提取液总量(10ml)／测定液用量(2ml) R --- 反应液总量(４ml) Ｗ --- 植物材料鲜重或干重(g) 0.155 --- 丙二醛的摩尔浓度消光系数(当[MDA]=1nmol/ml时,OD532-OD600=0.155) [即( OD532—OD600) / 0.155的单位为1nmolMDA / ml ] 室温下处理的叶片在523nm出的光密度值 次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 OD523 -0.006 -0.007 -0.011 -0.012 -0.003 0.023 0.025 -0.016 -0.003 0.012 -0.0022 室温下处理的叶片在600nm出的光密度值 次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 OD600 -0.027 -0.054 -0.054 -0.027 -0.042 -0.027 -0.043 -0.042 -0.042 -0.027 -0.039 室温下丙二醛含量（nmol·g-1）= =-0.0022+0.039/0.155×4×10/2×1=4.75 nmol·g-1 冷处理下的叶片在523nm出的光密度值 次数 1 2 3 4 5 6 7 平均值 OD523 0.078 0.077 0.077 0.076 0.078 0.076 0.076 0.077 室温下处理的叶片在600nm出的光密度值 次数 1 2 3 4 5 6 7 平均值 OD600 0.025 0.026 0.026 0.027 0.027 0.026 0.026 0.026 冷处理下丙二醛含量（nmol·g-1）= =0.077-0.0