生理指标的测定1重点分析.docVIP

一 叶绿素的测定-丙酮乙醇提取比色法 参照张宪政（1986）的方法: 1、先配制乙醇：丙酮=1：1的混合溶液（80%:80%）装入棕色瓶中保存。 2、取叶片0.5-1g剪碎，放入50 ml的培养瓶中，再加入20 ml的配制好的上述混合液，盖上瓶盖，置于10℃冷库避光存放36 h(直到叶片泛白)，其间摇晃2-3次，使叶绿素充分溶解在混合液中。 3、避光保存36 h后，过滤混合溶液，以提取液作为对照，在紫外分光光度计下分别测定652 nm、663 nm和645 nm处的吸光值。 4、计算公式 叶绿素a的含量=（12.7*OD663-2.69*OD645）/50+（22.9*OD663-4.68*OD645）/50 叶绿素b的含量=（22.9*OD663-4.68*OD645）/50 总叶绿素的含量=（20.2* OD645+8.02* OD663）*V/1000*W 或 总叶绿素的含量=(A652 /34.5)*V/1000*W (叶绿素a和叶绿素b在652nm下有相同的吸光系数，为34.5) 其中V为提取液体积，W为叶片重量，叶绿素含量单位为mg/g(FW). 二、维生素C含量的测定 李合生，2000年，比色法：常规测定抗坏血酸的方法是采用2，6—二氯酚靛酚滴定法，但因某些叶片中花青素量较高，当用酸提取时呈红色，因而无法滴定。本实验采用二甲苯萃取比色法，测不受花青素的干扰。 1、原理：向一定量提取液中加入过量的2，6—二氯酚靛酚染料溶液与维生素C作用后，多余染料用二甲苯萃取比色。待测液中抗坏血酸的含量与二甲苯萃取的颜色呈线性负相关，即待测液中抗坏血酸含量越多，未被还愿的染料就越少，二甲苯萃取的颜色也就越浅。由于水溶性的花青素不溶于二甲苯，因而不影响测定结果。 2、试剂 （按照定容100ml计算） (1) 1%草酸，称取1.4g； (2) 2%草酸, 称取2.8g； (3) 30%硫酸锌, 称取53.4g； (4) 15%亚铁氰化钾, 称取17.2g； (5) 染料溶液：称取100mg2，6—二氯酚靛酚和82mg碳酸氢钠溶于约60ml热水中，过滤定容至100ml容量瓶中，倒入棕色试剂瓶存放于冰箱内。使用时稀释4倍，此溶液每毫升约相当于0.1mg的维生素C。 (6) 抗坏血酸标准溶液：精确称取100mg分析纯抗坏血酸，溶于1%草酸，定容至100ml，再从中吸取5ml，用1%草酸再稀释至100ml, 稀释后每毫升含抗坏血酸0.05mg（标准溶液在使用前临时配置） (7) 二甲苯,分析纯（本法使用过的二甲苯可用20%NaOH中和后，蒸馏回收）。 3、实验步骤 (1) 标准曲线 去具塞大试管6个，分别吸取抗坏血酸标准溶液0ml、1ml、2ml、2.5ml、3ml、4ml，用1%草酸补充至4ml，各管中抗坏血酸含量相应为0mg、0.05mg、0.10mg、0.125mg、0.15mg、0.20mg。各管中加入染料溶液2ml，随即加入二甲苯5ml, 迅速摇动约0.5min, 静置后二甲苯与水层分离，将上层二甲苯萃取液轻轻倒入比色杯，在500nm波长下测定吸光度。以二甲苯作空白调零，求得标准系列抗坏血酸毫克数与相应的吸光度值的回归方程。 (2) 样品提取 取新鲜蔬菜洗净，擦干，在玻板上用不锈钢刀切碎混匀。称取2g样品放置研钵中，加入3ml2%草酸研钵至匀浆，然后将匀浆倒置100ml容量瓶中，残渣用1%草酸冲洗，洗液一并倒置容量瓶中，加入1ml30%硫酸锌，摇动容量瓶，再加入1ml15%亚铁氯化钾，以除去脂溶性色素，再用1%草酸定容至刻度，摇匀后过滤到干净小烧杯中。 （3）测定 取上述提取液4ml(若抗坏血酸含量高，可适当减少取量，不足4ml的可用1%草酸补足至4ml)至具塞大试管中，依次加入染料2ml、二甲苯5ml，按照标准曲线的方法测定吸光度。 （4）计算 根据测定液的吸光度值，按回归方程计算出抗坏血酸的毫克数，然后按下式计算样品中的抗坏血酸的含量，以每百克鲜样含抗坏血酸毫克数（mg/g）表示。 每克鲜样的抗坏血酸含量=X*Vt/(W*Vm)（mg/g） 式中；X为4ml提取液中含抗坏血酸的毫克数；Vt为提取液总体积ml；W为样品鲜重g；Vm为测定用体积量ml。 三、蛋白质的测定—考马斯亮蓝法 1、 称取10 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 100 μg／ml的原液。称取100 mg考马斯亮蓝G－250，溶于50 ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100 ml，最后用蒸馏水定容到 1000 ml。 标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。 操作项目 管 号 1 2 3 4 5 6