沈萍微生物学第十章微生物与基因工程讲义.docx

微生物与基因工程 genetic engineering Genetic engineering 基因工程：实现基因克隆所采取方法及相关的工作统称为重组DNA技术或重组DNA工艺学或基因工程 一 重组DNA技术相关概念 Clone :来自同一始祖细胞的相同副本或拷贝的集合；获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)也就是无性繁殖。 DNA clone:应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子（复制子replicon），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆，又称为重组DNA recombinant DNA。 replicon 复制子：在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子。 DNA chimeras嵌合DNA：克隆某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子，称为嵌合DNA。 二 基因工程基本过程 1基因的分离或合成：基因文库或cDNA文库分离；化学合成；PCR；定点诱变改造基因 2外源基因与载体DNA的体外重组：利用重组DNA技术将外源基因插入质粒、病毒或染色体DNA构建成的载体中含有自主复制起点的“重组DNA分子” 3重组DNA导入宿主细胞通过转化、转染或感染等方式将重组DNA导入微生物或动植物细胞中，使其复制，获得克隆 4目的基因的筛选与鉴定：获得克隆后进行鉴定和测序 5控制外源基因的表达：控制适当条件是导入基因在细胞内表达，产生产品，或使生物体获得性状。获得新性状的微生物称为工程菌，新类型的动植物非别称为工程动物和工程植物或转基因动、植物 三 微生物与基因工程的关系： 1微生物为基因工程提供了及其丰富的基因资源； 2基因工程所用的载体主要由质粒、噬菌体和其他病毒DNA改造而成； 3基因工程所用的工具酶绝大多数从微生物中分离纯化得到； 4微生物细胞是基因克隆的宿主，即使动、植物基因工程也需要构建穿越载体； 5微生物是基因表达的生物反应器； 6微生物研究能为基因工程提供理论研究 第二节 基因的分离、合成的定位诱变 一 从基因文库或cDNA文库中分离目的基因target gene 1从基因文库中分离目的基因：先构建基因组文库后筛选目的基因 target gene有两种类型：cDNA和基因组DNA。 gene library 基因文库：是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。 cDNA complementary DNA：指经反转录合成的、与RNA（通常为mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。 genetic DNA 基因组DNA：指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体及线粒体）的所有DNA序列。 （1）gene library 构建分为五步： 1从组织或细胞中提取基因组DNA； 2利用限制性酶水解或机械剪切力将其切成适当长度的DNA片段； 3选择克隆载体，通常采用λ噬菌体载体或粘粒载体； 4基因组DNA片段与载体DNA进行体外连接； 5重组DNA直接转化细菌或用体外包装的重组λ噬菌体粒子感染敏感细菌细胞，最后得到基因文库。 （2）基因文库中筛选目的基因 利用标记基因探针、限制性内切酶、PCR或其他方法从文库中筛选出目的基因。常将克隆菌落或噬菌斑转印到滤膜上再用基因探针与之杂交；若构建基因表达文库，可通过检测基因产物来筛选。 2 从cDNA文库中分离基因 cDNA library cDNA文库：指细胞全部mRNA为模板逆转录成cDNA，与适当载体接合转入受体菌，即获得cDNA文库。 mRNA 丰度 mRNA abundance：指一种特定的 HYPERLINK /view/32989.htm \t _blank mRNA在某个 HYPERLINK /view/3687.htm \t _blank 细胞中的平均分子数。 低丰度的mRNA需要由公式计算出使其存在概率达99%的最低克隆数目 （1）cDNA文库构建 A 具体方法为五步： 1从组织或细胞中提取基因组mRNA； 2利用逆转录酶以寡聚（dT）or随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA第一条链； 3利用DNA pol I以cDNA第一条链为模板，以适当引物合成第二条链。常用RNA 酶H在杂交分子的mRNA链上造成切口或缺口，水解留下的RNA片段即可作为引物，或除去杂交分子的mRNA后加入随机引物即可合成第二条链； 4cDNA与载体体外连接； 5噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。 由于cDNA不含基因启动子和内含子，故序列比基因短，克隆载体可用质粒或病毒载体。 B cDNA文库的优点： 1筛选到目的基因，通常细胞中仅有15%左右基因被表达，故cell中mR