赤松松针原花青素抗氧化活性概述.doc

赤松松针原花青素的抗氧化分析 摘要：本文利用DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼Sephadex LH-20 的纯化，测定了松针高温水提物的抗氧化活性。结果表明第7组分和第12组分含有的原花青素和儿茶素的含量最高，抗氧化能力最强。这些结果表明松针高温水提物的抗氧化能力与其所含有的高聚原花青素和单体儿茶素的含量成正相关。此外，松针高温水提物的抗氧化能力与常见的抗氧化剂，如维生素C类似，这表明，松针含有的原花青素和儿茶素可能用作另一种抗氧化剂。 关键词：DPPH；ROS；HPLC分析；原花青素；松针 1 前言 自由基和其他活性氧物质是机体在某些外源性化学物质入侵或内源性代谢过程中产生的。活性氧（ROS），包括超氧自由基（O2-）、羟自由基（OH-）、过氧化氢（H2O2），能与DNA、脂质和蛋白质迅速反应，造成细胞损伤。有研究表明，一些酶具有清除H2O2，保护细胞免受活性氧伤害的作用[1]，这些酶包括超氧化物歧化酶过氧化氢酶谷胱甘肽过氧化物酶(Pinaceae)植物，在世界各地广泛种植。在东亚，如韩国和中国等国家，松树的各个部分，包括松针、松实、松树皮、松香，均可食用或制成保健品[4]。在亚洲，松针还被制成饮料，该松针饮料甚至可以作为普通治疗高血压等的药品[5]。此外，松针还能抑制白血病细胞的生长[6]和防止羟自由基的氧化作用导致的DNA损失和诱导细胞凋亡 [7]。和从类似的材料（如松树皮）的提取物一样，松针还具有其他的生物学效应，比如药理性的抗氧化、抗增殖、抗炎作用[8-10]。 原花青素，又称为缩合单宁，是最古老的植物次生代谢物。这些化合物在木本植物中广泛存在，但发现在草本植物中也含有一定的原花青素。随着茶和其他具有生物学效应的植物产品的出现，人们发现儿茶素和原花青素具有强抗氧化能力[11,12]。红葡萄酒和葡萄籽的多酚类成分主要是原花青素，具有强效的抗氧化活性[13,14]。最近，大量的研究表明，除了抗肿瘤作用，原花青素还能增强化疗的作用，同时拮抗化疗药物对正常细胞的毒性[15,16]。原花青素是生物类的黄酮，天然的多酚化合物，以黄烷-3-醇（+）-儿茶素、（-）-表儿茶素Sephadex LH-20分离其中的原花青素，之后测定其抗氧化活性。 2 材料与方法 2.1试剂： 2,2-二苯基-1-苦肼DPPH），L（+）-（+）-儿茶素Acetonitril HPLC ultra Gradient和methanol HPLC：JT Baker (美国新泽西州)； Sephadex LH-20：GE Healthcare (瑞典斯德哥尔摩)； α-MEM Hanks 平衡盐溶液(HBSS)，FBS：Gibco BRL (美国纽约格兰德岛)； 磷酸：JUNSEI (日本东京)； DCF-DA：Invitrogen 公司(美国加利福尼亚)。 2.2 松针提取物的制备 根据以往的研究，用研钵将松针研磨成粉[19]。1Kg松针分别溶于2L蒸馏水、乙醇、己烷，80℃水浴加热12h，得到相应的提取物。然后收集水溶性馏分，分别用乙醇（HWE）和己烷（HWH）提取。12h后，用Whatman滤纸进行减压过滤，得到松针提取物滤液和固体残渣。将滤液至于-20℃备用。 2.3 DPPH（2,2-二苯基-1-苦肼Duan等人[20]研究的测定样品清除DPPH自由基的能力的方法，将各提取物稀释并溶于99%甲醇中，并配置一系列浓度为1,000μg/mL、μg/mL、 μg/mL、 μg/mL、 μg/mL 、10 μg/mL的待测样品，置于96孔的微板上。准确量取100μL不同浓度的待测样品，分别置于试管中并依次加入2,900μL配置好的DPPH·溶液（120 μM），混合均匀，将试管置于室温下反应30 min，反应完成后用酶标仪在517 nm下测定吸光值。由下式计算各种松针提取物清除DPPH的能力： DPPH清除率（%）=[(A0-A1)/ A0] ×100 A0-空白溶液的吸光度A1-待测液的吸光度α-MEM（Gibco BRL ，美国纽约格兰德岛），于5%CO2，37℃的培养箱中培养，培养液每周换两次。然后弃培养基，加入PBS清洗细胞两次，轻轻洗去培养基，得到单层细胞。将细胞移入离心管，1,100rpm离心3min。然后加入α-MEM Hanks 平衡盐溶液(HBSS)和DCF-DA，在37℃下反应2h得到细胞悬浮液。反应结束后，去除HBSS，加入PBS。将所得到的含有DCF-DA的MC3T3-E1成骨细胞接种在96孔微板上，加入50μg/mL的松针提取物（或10μg/mL原花青素标准物）和H2O2。采用多功能微孔板检测仪485nm，发射波长528nm，测量每个孔中的荧光强度。 2.5 赤松松针原花青素的高效液相色谱分析（HPLC-UV