CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介要点.pptVIP

染色质免疫沉淀实验(CHIP) 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。 Chi SW, Zang JB, Mele A, Darnell RB. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 2009 Jul 23;460(7254):479-486. * * Chromatin Immunoprecipitation Assay (ChIP) 染色质免疫沉淀实验 基因表达:反式因子和顺式作用元件之间相互作用。 真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。 研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核基因表达机制的基本途径。 概述 原理 方法 比较 举例 ?基因表达调控 功能基因组学? 概述 原理 方法 比较 举例 CHIP原理 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物 将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段 通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段 对目的片断的纯化与检测 概述 原理 方法 比较 举例 概述 原理 方法 比较 举例 操作步骤 一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。 二、免疫沉淀 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。 三、纯化与检测 经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况. 概述 原理 方法 比较 举例 概述 原理 方法 比较 举例 注意事项 超声波破碎条件的选择 抗体量的选择 PCR反应条件的选择 概述 原理 方法 比较 举例 Input对照 阳性对照：如组蛋白抗体 阴性对照：阴性引物 条件选择 对照设置 比较： 蛋白质-DNA相互作用常用方法 凝胶电泳迁移率改变分析 （EMSA） DNaseⅠ足迹法（foot printing） 染色质免疫沉淀实验(CHIP) 体 内 体 外 概述 原理 方法 比较 举例 能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。 由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，EMSA获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。 CHIP EMSA 概述 原理 方法 比较 举例 应用举例 概述 原理 方法 比较 举例 Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920. 概述 原理 方法 比较 举例 Saleh A, Alvarez-Venegas R, Avramova Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 2008;3(6):1018-1025. 扩展应用举例 CHIP-on-chip 概述 原理 方法 比较 举例 概述 原理 方法 比较 举例 crosslinking immunoprecipitation (CLIP) For microRNA–mRNA interaction Ago----argonaute蛋白