幽门螺杆菌alpA基因在乳酸菌中的表达和免疫原性分析.pdfVIP

中田医学科学院医学生物研究所顺lj．[{Jf究乍毕业论义 目 录 摘要……………………………………………………．．1 前。言……………………………………………………．．4刖舌……………………………………………………··4 一实验材料及方法…………………………………………．8 (一)实验材料…………………………………………．．8 (二)基本实验操作………………………………………10 (三)a捌基因的扩增及其表达载体的构建……………………14 (五)重组蛋白的Westernblot分析………………………．．18 (六)免疫用灭活幽门螺杆菌的制备…………………………．18 (七)免疫用乳酸菌的制备…………………………………19 (八)表达alpA蛋白的重组乳酸菌的免疫原性分析………………．20 二结果与分析……………………………………………．22 (一)幽门螺杆菌基因a捌的扩增及表达载体的构建……………．22 (二)重组蛋白alpA的诱导表达……………………………．24 (三)重组蛋白的Westernblot分析………………………．．27 (四)表达alpA蛋白的重组乳酸菌的免疫原性分析………………28 三讨论…………………………………………………．3l 四小结…………………………………………………．36 参考文献…………………………………………………．37 综述……………………………………………………．42 附录……………………………………………………．57 致谢……………………………………………………．63 研究生简历………………………………………………．．64 论文独创性声明……………………………………………．65 lymphoidtissue，MALT)淋巴瘤的发生密切相关，被wHO确定为I类致癌因子。 研制疫苗是控制HpyfD一感染及相关疾病经济有效的途径。 随着对H砂fD一致病性的深入研究，人们发现Hp)，肠疗的致病因子包括诸多 因素，如尿素酶、过氧化氢酶、热休克蛋白、黏附素等，但尤以黏附素最为关键。 黏附素口聊编码518个氨基酸，体外黏附实验证明，其位于细菌表面且其融合蛋 白的抗血清能够完全阻止H矽y肠一对胃组织的黏附。R锄om等学者通过豚鼠模 型证实口聊、口邶缺陷对Hpy，D一的黏附定植十分不利，口别的免疫原性在动 物模型中已经有实验室证据。 乳酸菌是人和动物肠胃中正常存在的菌群，被公认为安全级微生物，已广泛 地应用于食品及饮料加工业。并且乳酸菌进入肠道后能发挥佐剂的活性刺激机体 的粘膜免疫反应。乳酸菌和可降解的生物颗粒大小差不多，可以被粘膜M细胞 摄取，故可作为一种有效的口服疫苗载体。本实验利用分子克隆技术扩增了 只∥肠一的口聊基因，并构建携带口柳基因的重组原核表达质粒pNICE：sec-alpA， 将重组质粒转化乳酸菌Nz9000株，优化表达条件后，以舷4在乳酸菌中获得表达， 表达量占菌体蛋白总量的9．6％。表达的蛋白能与兔抗Hp)，fDrf血清特异性反应， 具有良好的免疫原性。用重组表达alpA蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后能刺激小 鼠产生特异性的IgG和IgA。 实验结果表明以乳酸菌作为递送载体的口服疫苗可以刺激机体产生局部的 粘膜免疫反应和全身的系统免疫反应。这对于Hp)，fD一的治疗和预防都有重要的 意义，将有可能是一种具有很好发展前景的新型疫苗。本实验对乳酸菌作为抗原 递送载体进行了初步尝试，为H砂，0一口服疫苗的开发提供一定的实验依据。 [关键词]幽门螺杆菌；乳酸乳球菌；a捌基因 中固医学科学院医学生物研究所硕Ij_fiJf究生毕业论文 摘要 ABSTRACT a bacillusthatinfectsthe 月a疗co蚰c胞，．刃，肠力isGram-negatiVe microaerophilic ofmorethan stomachs halfofthe hasbeen glo