神经生长因子诱导人神经母细胞瘤细胞分化实验研究.pdf

体在IMR-32细胞系中恢复表达之后，转化细胞系对NGF诱导分化的反应， 以及进—步恢复高和低两种亲和性神经生长因子受体同时表达后，双重转 化细胞系对NGF诱导分化的反应及适时撤药后细胞的生存状态。 ／ f我们首先利用基因重组技术，构建了表达高亲和性神经生长因子受体基 ＼、 因trk A的逆转录病毒载体，经双向包装细胞系PA317包装后，病毒上清 感染I积一32细胞，经筛选得到抗性克隆，扩大培养后，经Southernblot， RT-PCR及流式细胞分析术，证实有外源基因的整合与稳定表达，转化细 胞经NGF诱导出现了明显的分化反应，而未转化的母系及空病毒转化细胞 系均未见．分化反应，同时作为平行对照的低亲和性神经生长因子受体转化 细胞系对NGF诱导仅有轻微的分化反应；高亲和性神经生长因子受体转化 细胞系在出现明显分化之后，撤去NGF，细胞继续维持分化状态．不再回 到原来非分化的幼稚状态，细胞恶性表型得到较为完全的逆转；但未诱导 分化的细胞则仍继续增殖。 进而我们又构建了与外源trkA表达载体筛选标记不同的低亲和性神 经生长因子基因的表达载体，并同时转化IMR-32细胞系，通过双药物筛 选，获得了双抗性克隆，培养后，经RT-PCR及流式细胞术证实，双重转 化细胞中含有高和低两种亲和性神经生长因子受体的表达，继而进行NGF 诱导分化实验及撤药后细胞生存状态观察并与分别转有两种神经生长因子 受体的单独转化细胞系及母系进行对照。结果表明，双重转化细胞系在NGF 诱导下较trk A单转细胞系更快出现神经元样分化，轴突生长数量更多， 分化高峰时间较单转细胞明显提前，在转化细胞明显分化之后撤去NGF， 双重转化细胞系中NGF诱导分化的细胞在撤药3-5天后大量凋亡，对NGF 生存依赖性明显上升，而trkA单转细膨-E／f4B后对NGF不产生生存依赖， 撤去NGF之后仍然维持分化状态，在有限的观察期内未见分化逆转，也未 见明显的凋亡细胞产生，低亲和性神经生长因子受体单独转染细胞与上述 两种细胞相比，在撤药后仅有轻微分化的细胞形态发生逆转，1-2周后形 态逐渐向母系靠近，凋亡细胞未见明显增多。 IMR-32细胞系在裸鼠体内具有致瘤能力，移植瘤依然保持了体外培 养细胞系的主要细胞生物学指征及恶性行为特点，特另Ⅱ是肿瘤细胞仍具有 MYCN癌基因产物的高表达，为今后尝试反义IlNA基因治疗提供了良好的 实验模型；而神经生长因子受体转化的细胞系，无论单转还是双转细胞系， 均未能在裸鼠体内形成肿瘤，提示神经生长因子受体的基因转染本身可影 响靶细胞的生物学行为而具有某种程度的促进肿瘤细胞逆转的作用。／。 实验结果提示：在NGF诱导分化过程中：高亲和性和低亲和性神经生 …一 ‘、 、长因子虽信号通不同．但可能具有重要的协同作用，从而大大增强了NGF 诱导分化的作用。使瘤细胞出现明显的接近终极的分化。高亲和性NGF受 体可能增强低亲和性受体的促进凋亡的作用。 本研究为人神经母细胞瘤的实验性基因治疗提供了有价值的资料。 Research Basie OnNGF-InducedDifferentiatlon Cdk tumor ofthe ofthe IIefVOUS one peripheralsystem,is NeurobtastomaO妯),a in some mostcommon dfildhood．In malignandes in tumor tumor othef the regress padeam，the