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小麦籽粒蛋白组分测定方法
小麦籽粒蛋白质组分的测定步骤
一、实验原理
植物种子蛋白质的85 % ~ 90 %是储藏蛋白,只要分布在胚乳或子叶中。植物种子种的蛋白质根据其溶解特性划分四中类型,即清蛋白溶于水和稀盐溶液;球蛋白不溶于水,但溶于稀盐溶液;醇溶蛋白不溶于水,但溶于70 % ~ 80 %的乙醇中;谷蛋白不溶于水、醇中,但溶于稀酸、稀碱中。根据蛋白质组分在不同溶剂中的溶解性,可按顺序用蒸馏水、稀盐、乙醇、稀碱分别提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白,分别收集提取液,再用考马斯亮蓝G-250或其他方法测定各蛋白组分,本实验采用考马斯亮蓝G-250方法测定。
二、材料、仪器和试剂
小麦面粉,万分之一天平,离心机,玻璃棒,振荡器,10ml离心管,50ml容量瓶等;
考马斯亮蓝G-250,一级水,10 %NaCl溶液,70% CH3CH2OH溶液,0.2% NaOH溶液。
三、蛋白质组分的提取
1.清蛋白的提取:万分之一天平准确称取面粉样品0.5g,置于10ml离心管中,加入一级水3ml,用玻璃棒搅拌均匀,2ml一级水冲洗玻璃杯,在水浴振荡器上220rpm振荡30min,4000rpm离心15min,取上清夜移入50的容量瓶。向离心管的沉淀中加入5ml 一级水搅拌,再离心和振荡。同一离心管的样品重复提取3次,每次离心的上清夜都移到同一容量瓶内,最后用一级水定容至50ml,待测。
2.球蛋白的提取:向离心管中的残渣加入3ml 10% NaCl溶液搅拌均匀,再用2ml 10%NaCl溶液冲洗玻棒,振荡和离心步骤同清蛋白。最后用10% NaCl溶液定容至50ml,待测。
3.醇溶蛋白的提取:向离心管中的残渣加入3ml 70% CH3CH2OH溶液搅拌均匀,再用2ml 70%CH3CH2OH溶液冲洗玻棒,220 rpm振荡1h,4000rpml离心15 min,上清液移入50ml容量瓶,重复提取3次,最后用70% CH3CH2OH定容至50ml,待测。
4.醇溶蛋白的提取:向离心管中的残渣加入3ml 0.2% NaOH溶液搅拌均匀,再用2ml 0.2% NaOH溶液冲洗玻棒,220 rpm振荡1h,4000rpml离心15 min,上清液移入50ml容量瓶,重复提取3次,最后用0.2% NaOH溶液定容至50ml,待测。
四、标准曲线制备
考马斯亮蓝G-250:准确称取100 mg 考马斯亮蓝G-250,溶于95 %CH3CH2OH溶液中,加入85 %的(W/V)磷酸100 ml,最后用一级水定容至1000 ml,过滤后于4℃冰箱保存备用。
牛血清蛋白标准液:准确称取牛血清蛋白100 mg,均匀溶于1L 一级水中,取此溶液5 ml加一级水稀释至50 ml,即为0.l mg/ml牛血清蛋白标准液,分别置于10 ml具塞试管中,各加一级水至1 ml,再加入5 ml的考马斯亮蓝G-250溶液,将试管内的溶液混匀,室温下放置2 min,以1 ml一级水加5 ml的考马斯亮蓝G-250溶液为空白,在595 nm下测定溶液吸光度,每一浓度重复测定3次\,后按下表绘制标准曲线。
蛋白组分 试管编号 1 2 3 4 5 6 0.1mg/L牛血清蛋白标准液 /ml 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 考马斯亮蓝 /ml 5 5 5 5 5 5 清蛋白 一级水 /ml 1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 球蛋白 10 % NaCl溶液/ml 醇溶蛋白 70% CH3CH2OH溶液 /ml 谷蛋白 0.2% NaOH溶液 /ml 蛋白质含量 /ug 0 0.01 0.03 0.05 0.07 0.09 吸光度 五、样品蛋白含量计算
样品蛋白质含量质量分数 (%)=(Y×50×100)/(W×6×106)
式中:
A:样品测定液中蛋白质的含量,也就是标线中的Y,ug;
W:样品重量,g;
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