小麦籽粒蛋白组分测定方法.docVIP

小麦籽粒蛋白质组分的测定步骤 一、实验原理 植物种子蛋白质的85 % ~ 90 %是储藏蛋白，只要分布在胚乳或子叶中。植物种子种的蛋白质根据其溶解特性划分四中类型，即清蛋白溶于水和稀盐溶液；球蛋白不溶于水，但溶于稀盐溶液；醇溶蛋白不溶于水，但溶于70 % ~ 80 %的乙醇中；谷蛋白不溶于水、醇中，但溶于稀酸、稀碱中。根据蛋白质组分在不同溶剂中的溶解性，可按顺序用蒸馏水、稀盐、乙醇、稀碱分别提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，分别收集提取液，再用考马斯亮蓝G-250或其他方法测定各蛋白组分，本实验采用考马斯亮蓝G-250方法测定。 二、材料、仪器和试剂 小麦面粉，万分之一天平，离心机，玻璃棒，振荡器，10ml离心管，50ml容量瓶等； 考马斯亮蓝G-250，一级水，10 %NaCl溶液，70% CH3CH2OH溶液，0.2% NaOH溶液。 三、蛋白质组分的提取 1．清蛋白的提取：万分之一天平准确称取面粉样品0.5g，置于10ml离心管中，加入一级水3ml，用玻璃棒搅拌均匀，2ml一级水冲洗玻璃杯，在水浴振荡器上220rpm振荡30min，4000rpm离心15min，取上清夜移入50的容量瓶。向离心管的沉淀中加入5ml 一级水搅拌，再离心和振荡。同一离心管的样品重复提取3次，每次离心的上清夜都移到同一容量瓶内，最后用一级水定容至50ml,待测。 2．球蛋白的提取：向离心管中的残渣加入3ml 10% NaCl溶液搅拌均匀，再用2ml 10%NaCl溶液冲洗玻棒，振荡和离心步骤同清蛋白。最后用10% NaCl溶液定容至50ml，待测。 3．醇溶蛋白的提取：向离心管中的残渣加入3ml 70% CH3CH2OH溶液搅拌均匀，再用2ml 70%CH3CH2OH溶液冲洗玻棒，220 rpm振荡1h，4000rpml离心15 min，上清液移入50ml容量瓶，重复提取3次，最后用70% CH3CH2OH定容至50ml，待测。 4．醇溶蛋白的提取：向离心管中的残渣加入3ml 0.2% NaOH溶液搅拌均匀，再用2ml 0.2% NaOH溶液冲洗玻棒，220 rpm振荡1h，4000rpml离心15 min，上清液移入50ml容量瓶，重复提取3次，最后用0.2% NaOH溶液定容至50ml，待测。 四、标准曲线制备 考马斯亮蓝G-250：准确称取100 mg 考马斯亮蓝G-250，溶于95 %CH3CH2OH溶液中，加入85 %的（W/V）磷酸100 ml，最后用一级水定容至1000 ml，过滤后于4℃冰箱保存备用。 牛血清蛋白标准液：准确称取牛血清蛋白100 mg，均匀溶于1L 一级水中，取此溶液5 ml加一级水稀释至50 ml，即为0.l mg/ml牛血清蛋白标准液，分别置于10 ml具塞试管中，各加一级水至1 ml，再加入5 ml的考马斯亮蓝G-250溶液，将试管内的溶液混匀，室温下放置2 min，以1 ml一级水加5 ml的考马斯亮蓝G-250溶液为空白，在595 nm下测定溶液吸光度，每一浓度重复测定3次\，后按下表绘制标准曲线。 蛋白组分 试管编号 1 2 3 4 5 6 0.1mg/L牛血清蛋白标准液 /ml 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 考马斯亮蓝 /ml 5 5 5 5 5 5 清蛋白 一级水 /ml 1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 球蛋白 10 % NaCl溶液/ml 醇溶蛋白 70% CH3CH2OH溶液 /ml 谷蛋白 0.2% NaOH溶液 /ml 蛋白质含量 /ug 0 0.01 0.03 0.05 0.07 0.09 吸光度 五、样品蛋白含量计算 样品蛋白质含量质量分数 (%)=（Y×50×100）/（W×6×106） 式中： A：样品测定液中蛋白质的含量，也就是标线中的Y，ug； W：样品重量，g；