分子生物学实验室工作手册第十二章程序.pptVIP

3.DNA乙醇浓缩沉淀 二.DNA的扩增---PCR 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。生物体外的特殊DNA复制。 原理：PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 PCR的注意事项 1.远离PCR仪及其他污染源制备PCR样品。 2.PCR的移液器与其他移液器分开使用，防止交叉污染。 3.实验过程中戴手套和口罩，尽量不要说话。 4.反应体系中最后才加DNA。 质粒 质粒（Plasmid）：是一类存在于细菌和真菌细胞中独立于DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子（covalently closed circular DNA）,也称为cccDNA,其大小通常在1~100KB范围内。 质粒的分类 质粒分为两类： 1.严紧型质粒，当细胞染 色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒； 2.松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。 质粒 质粒的形式： ①超螺旋DNA：在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存 在。 ②开环DNA：如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处 断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛 型的环状分子，称开环DNA。 ③线状DNA：如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则 形成线状DNA(LinearDNA）。 当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分 子的泳动速度快。 当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA的两条 链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变 性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超 螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。 质粒的提取 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤： 1.培养细菌使质粒扩增； 2.收集和裂解细胞； 3.分离和纯化质粒DNA。 采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁。 十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。 经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。 分子生物学实验室工作手册 分子生物学实验室工作手册 第十二章：DNA、RNA、蛋白质 蛋白质 DNA RNA DNA DNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度。DNA对紫外线有吸收作用，当核酸变性时，吸光值升高；当变性核酸可复性时，吸光值又会恢复到原来水平。温度、有机溶剂、酸碱度、尿素、酰胺等试剂都可以引起DNA分子变性，即使得DNA双键间的氢键断裂，双螺旋结构解开。 DNA介绍 DNA是相当稳定的，这是保存和传递遗传信息的所必备的条件。但是对待DNA也不能大意，常常会DNA的污染。污染主要来源于其它的DNA。 DNA的分离 概述： 1.DNA的分离现已多用试剂盒提取，有小量，中量，大量提取三种。实验室一般销小量提取多见。 2.试剂盒可分离基因组，染色体组以外的DNA。如：琼脂糖凝胶中分离DNA、PCR产物中分离DNA。 3.一般分离试剂盒是使用结合DNA的树脂或者滤膜，避免了酚抽提和CsCl超离心。 4.染色体外的D