基因工程的主要技术原理(植物基因工程)概论.ppt

如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)，与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活报告基因(reporter gene)的转录与表达。 通过检测报告基因的表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物”这两个蛋白质之间是否存在相互作用。 酵母双杂交的载体质粒 DB载体质粒 AD载体质粒 1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞 3. 对酵母转化子进行自激活检测 4. 将重组载体共转化酵母菌细胞 5. 检测报告基因表达产物 6. 分析酵母双杂交实验结果 BD AD BD AD BD AD 酵母双杂交操作主要流程 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。 基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察和检测实验结果。 酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本生命现象和规律。 4. 酵母菌生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规模的组学研究。 酵母双杂交技术的优点 1. 假阳性：自激活、多因子参与…… 假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白…… 低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况 酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括： 体外相互作用验证 体外亲和纯化、体外免疫共沉淀…… 哺乳动物细胞内验证 亚细胞共定位、体内免疫共沉淀…… 酵母双杂交技术的弱点： 1. 假阳性：自激活、多因子参与…… 假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白…… 低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况 酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括： 体外相互作用验证 体外亲和纯化、体外免疫共沉淀…… 哺乳动物细胞内验证 亚细胞共定位、体内免疫共沉淀…… 酵母双杂交技术的弱点： 2. 免疫共沉淀 免疫共沉淀原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 prorein A: Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质,能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合。 优点： 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 缺点： 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用； 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性； 必须制作相应蛋白的抗体。 3. 双分子荧光互补 荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 原理 　 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。 流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→（染色体显带）→荧光显微镜检测→结果分析。 五、荧光原位杂交 六、Western杂交 原　理 　 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤