基因工程基本技术概论.ppt

原理： 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性 与复性的差异而达到分离目的.当PH≥12.6时，染色体DNA与质粒 DNA的变性.当PH＝7时，质粒DNA复性，溶解在溶液中.而染色体DNA不能复性，形成缠 连的网状结构，离心后沉淀下来. 具体操作步骤 1．挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2mlLB(含相应抗生素)液体培养基中，37℃250转／分钟振荡培养过夜(约12-14h)。 2．取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g lmin，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。 3．将细菌沉淀重悬于100ul预冷的溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 4．加200ul新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。 5．加入150ul预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K使SDS—蛋白复合物沉淀。 6．加人450ul的苯酚／氯仿／异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g10min。 7．小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2.5min，4℃离心12000g 15min。 8．1ml预冷的70％乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g 7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。 9．沉淀溶于20ulTE(含RNase A 20ug／m1)，37℃水浴30min以降解RNA分子，—20℃保存备用。 步骤： ⅰ.用TE或dH2O稀释样品，1：20或更高。 ⅱ. 用TE或dH2O作空白，在波长260nm及280nm处调节 紫外分光光度计读数至零。 ⅲ. 加入DNA稀释样品于上述二波长处读取OD值。 计算浓度： [dsDNA] ＝50×OD260 ×稀释倍数 (ug/ml) [ssDNA]or[ssRNA] ＝40×OD260 ×稀释倍数 (ug/ml) 纯度： OD260 / OD280 ＝1.8, DNA OD260 / OD280 ﹥1.8, DNA 被RNA污染 OD260 / OD280 ﹤1.8, DNA被蛋白质污染 OD260 / OD280 ﹤0.9,需重新抽提除去蛋白质 OD260 / OD280 ﹥2,需重新抽提除去RNA 特点：能测浓度和纯度，准确，简便，但需较贵重的仪器紫外 分光光度计。 溴酚蓝(bromophenol blue，Bb)是带电荷的小分子化合物，呈蓝紫色。凝胶电泳的过程可以通过可见的染料(示踪染料)来监测。把这种示踪染料配制成上样缓冲液，在电泳前就同DNA样品一起加到每一个样品孔中，当示踪染料泳动到胶底部时，电泳结束。如溴酚蓝所带电荷量相当于300bp的DNA分子，通过观察溴酚蓝的迁移位置，就可估计样品中DNA分子的迁移位置。 （1） 凝胶缓冲液和电泳缓冲液 ： 在制备凝胶和进行电泳所使用的缓冲液是同一种缓冲液，目前常用的缓冲液有TAE(40 mol/L Tris—乙酸、lmmo1/L EDTA)、TBE(90 mmol/L Tris—硼酸、1mmol/L EDTA)和TPE（50mmol/ L Tris—磷酸、lmmo1/L EDTA)。TAE缓冲液的缓冲能力较低，适用于低电压长时间电泳；TPE缓冲液长时间使用后，需将正负极电泳槽的缓冲液混合后再使用；TBE有较强的缓冲能力，是比较通用的缓冲液。 （2）上样缓冲液 ： 为了不使样品扩散以及监测凝胶电泳的过程，样品加样前需和上样缓冲液(Loading Bufrer)混合。常用的加样缓冲液由蔗糖（40％w／v）、甘油（0．25％）和染料（0.25％溴酚兰）组成，其中蔗糖、甘油等是抗对流物质，染料(如溴酚兰)是指示剂。 1.制备凝胶 将电泳缓冲液和琼脂糖按质量百分比配制成浓度为0.5%—1.5%的混合液（具体浓度根据具体实验选择）。加热熔化，冷却至55℃，到入制胶盒，插上样品梳。待样品凝固后（约30min），拔出样品梳，在胶上形成样品孔。将胶放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽内，缓冲液高出凝胶表面约1mm。