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1. 实验目的 （1）学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理。 （2）掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的实验技术 2．实验原理 考马斯亮蓝G-250以两种不同颜色存在，红色与蓝色，该染料在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，蛋白质-色素络合物在595nm波长下有最大光吸收。其吸光值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 3. 实验材料、仪器与试剂 材料：奶粉 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。 试剂：考马斯亮蓝G-250，无水乙醇，磷酸，牛血清蛋白。 试剂配制： 考马斯亮蓝G-250试剂：称取0.1000g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95%乙醇中，加入85%磷酸100mL，用蒸馏水定容至1000mL。需要过滤 标准蛋白质溶液（100μg/mL）：称取100mg牛血清蛋白（BSA），溶于100mL蒸馏水中。制成100μg/mL贮备液。 按下表配成不同蛋白浓度标准液。P42 4. 实验步骤 （1）样品溶液制备：称20g奶粉，定容至1000ml. 稀释：5X, 10X, 20X (表一组用） 50X, 100X, 500X (表二组用） （2）标准曲线的绘制 P43 ①100-1000μg/mL蛋白标准曲线： ② 0-100μg/mL蛋白标准曲线： 取6支10mL具塞试管，按P42表各浓度蛋白标准液0.1ml，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，，摇匀，放置2min后于595nm波长下比色。空白以蒸馏水代替标准液，其他操作同上。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 （3）样品的测定 样品中蛋白质浓度的测定除加入标准溶液改为样品液外，其余操作完全相同。 5. 数据处理 通过标准曲线回归方程即可求得每毫升溶液中蛋白质的含量。 6. 注意事项 （1）考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。 （2）考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。 考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但可以被洗脱下去，所以可用来对电泳条带染色。 （3）不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。 （4）做线性回归。Y=ax+b （5）做标准曲线及测样同时进行，用一个空白。
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