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实验二 蛋白质的分离鉴定 ——纸层析法 目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成的。 物质被分离后在致层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的： Rf=原点到层析中心的距离/原点到层析剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本试验利用纸层析法分离氨基酸。 器材 1. 层析缸 2. 毛细管 3. 喷雾器 4.培养皿 5. 层析滤纸（新华一号） 试剂 1、扩展剂 650ml 是4份水和饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20毫升的正丁醇和5毫升的冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静止后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。 2、氨基酸溶液： 各5ml 0.5%的谷氨酸，亮氨酸，色氨酸，甘氨酸溶液及它们的混合液（各组分浓度均为0.5%）。 3、显色剂 50-100ml 0.1%水和茚三酮正丁醇溶液 操作方法 1、将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。 2、取层析滤纸（长22cm，宽14cm）一张。在纸的一端距边缘2～3cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如图。 3、点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这五个位置上，干后再点一次。每点在纸上的扩散直径最大不超过3mm。 4、扩展 用线将滤纸缝成筒状，只得两边不能接触。将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速的置于密封的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）到溶剂上升15-20cm时即取出滤纸，用铅笔描绘出溶剂前沿线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5、显色 用喷雾器均匀的喷上0.1%的茚三酮正丁醇溶液；然后置于烘干箱烘干5分钟（100℃）就可显现出各个层析斑点 6、计算分析： ①判断混合氨基酸中的单组分。 ②计算各种氨基酸的Rf值（各种单组分、混合氨基酸液）。 实验三 双水相萃取法的应用 目的要求 掌握双水相萃取法的基本原理及其在产物提取方面的应用 实验原理 利用不同物质在双水相系统中分配系数的差异，将不同物质分离。 材料和仪器 材料：鸡精、PEG（400～6000）、硫酸铵、pH试纸。 仪器：烧杯、分液漏斗。 实验方法 双水相系统的制备：分别称取12gPEG400和1000，加入两个烧杯中，加水至40mL使溶解，然后每个烧杯中分别加入硫酸铵6g使溶解，并加水至50mL，观察是否形成双水相，若无，每个烧杯中逐次增加硫酸铵1g，观察哪一个烧杯中双水相系统先形成，分析其原因。 将鸡精转入两个双水相系统中，搅拌均匀，测定pH值，静置观察分层情况及颜色变化，分析其原因。 两个双水相系统中，逐次改变pH值，观察两个双水相系统中上下层水相的颜色及混浊、沉淀等情况是否有变化，若有分析其原因。 思考题 双水相萃取的优缺点。 影响双水相萃取的因素有哪些？ 实验四 活性炭脱色 目的要求 掌握活性炭脱色的基本原理以及不同性质活性炭的脱色操作。 实验原理 活性炭表面有无数微小的空隙，因而具有很大表面积，能够将色素等杂质吸附在表面上。 材料和仪器 材料：鸡精、粉末活性炭、GH-15颗粒活性炭、NaOH、HCl、pH试纸。 仪器：烧杯、玻璃柱。 实验方法 粉末活性炭的脱色：取适量鸡精加水制成溶液，观察其颜色，然后加入一定量的粉末活性炭（其用量一般为鸡精量的3％左右），适当搅拌、静置过夜，观察颜色有无变化。 GH-15颗粒活性炭的脱色 GH-15颗粒活性炭的预处理：将活性炭装柱，加水充分浸泡4h后，用60℃水洗至流出液pH8以下，然后用两倍碳体积的3～4％HCl再生，自来水洗至pH6.5左右。 上柱脱色及水洗：上柱液顺向流过碳柱，控制流量为每小时碳体积的2～3倍。进柱完毕，用40℃以下温水洗去残存在碳柱内的谷氨酸钠（回收），直洗至流出液0°Be以下。 洗脱和再生：洗脱用水先进行反冲，使碳层松动，再用两倍碳体积的60℃4％NaOH，顺向上柱洗脱色素，待流出液pH9以下，关住阀门，让其浸泡4h，然后流出，再用60℃以上的热水洗涤至pH8.0以下。再生用两倍碳体积的3～4％HCl再生，先浸泡2 h，然后流出，再用自来水洗至中性。最后用自来水进行反冲，将碳末冲掉，至溢流水澄清即可停止反洗，平整碳柱，备用。 思考题 影响