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生制药发酵生产三要素蛋白质药物的缺点生产药物的天然微生物 菌种保存生产菌种须以休眠状态保存在砂土管或冷冻干燥管中，并置于0～4℃恒温冰箱(库)内。使用时可临时取出，接种后仍需冷藏。 使用期生产菌种一般都严格规定其使用期，一般砂土管为1～2年。 常用兼性贴壁依赖性细胞治疗性单抗 游离细胞使细胞膜和细胞质中大部分蛋白质和脂质被溶解抽提掉， 但细胞骨架系统蛋白质却不受破坏而被保存下来，经固定和染色后可在光镜下，见到网状结构的细胞骨架，然后融合某种细胞核酶在医药领域的应用菌种保藏的原理措施改善基因工程菌不稳定性的策略 基因工程菌高密度培养的优点影响质粒稳定的因素 ?质粒拷贝数 ?重组质粒的表达对质粒稳定性的影响 微生物转化反应的特点 ?反应速度快 ?反应条件温和 种子活化融合蛋白 单域抗体仅由重链构成，其抗原结合区仅是一个通过铰链区与Fc区连接的单结构域，而且这个抗原结合区自抗体上分离后仍具有结合抗原的功能，这就为抗体的分子构建提供了一个新方法。基于单域抗体的一系列优点，在免疫实验、诊断与治疗中，它将发挥超乎想象的巨大功能。人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。诱导子微生物转化 高密度培养灌流（注）式操作包涵体基因工程定义在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。 在下游生产过程中特别是在医药生产中，以包涵体形式表达的蛋白质具有一些优越性。 （1） 异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解，如果重组蛋白质以包涵体形式表达，由于包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击； （2） 包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质的失活问题； （3） 包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离； （4） 有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达； （5） 对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易进行在线观测定性，含有包涵体蛋白质的细胞有较大的折射率，不必像可溶的蛋白质需要细胞破碎后使用酶学或者电泳学的方法进行鉴定。愈伤组织 发酵生产中pH的影响及其控制基因工程药物的质量检控动物细胞培养要求 ?无细胞壁保护，细胞膜直接接触外界。 ?物理化学因素：渗透压、pH、离子浓度、剪切力等耐受力很弱，容易受伤害。 a粘度 ?培养基的粘度主要受血清含量的影响，在多数情况下，对细胞生长没有影响。 ?在搅拌条件下，用羧甲基纤维素增加培养基的粘度，可减轻细胞损害。 b氧气 ?动物细胞生长必须有氧气，缺氧时不能生存。 ?离体培养的气体：含有5％CO2和95％空气，其中氧浓度为21％。 c pH值 ?低于6.8或超过7.6对细胞产生严重影响，甚至使其死亡。 ?机体细胞的pH范围为6～8，而且血液和体液中变化范围很小。 ?酚红常用作指示剂 ?碳酸盐缓冲系统使用多。在生理pH值条件下的缓冲能力差。 d渗透压 ?动物细胞对渗透压有较强的耐受性 ?离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液。 ?增减NaCl的浓度调整渗透压 e支持物 ?玻璃 ?塑料制品 ?微载体使贴壁细胞可以像悬浮培养那样进行。微载体表面光滑，并带有少量正电荷，适于细胞贴附。 2 对培养基组成要求高 ?完全异养，容易利用、相对低分子量的营养物12种必需氨基酸，8种以上维生素，多种无机盐和微量元素 ?多种附加成分：生长类、细胞因子和贴壁因子因子及激素、结合蛋白质 ?能源：单糖，葡萄糖，谷氨酰氨 ?氮源：氨基酸单体化合物 抗体生产的发展趋势 固定化酶的酶学特性的变化发酵工程菌种选育改良的具体目标包涵体表达形式的优缺点。优点1能简化外源基因表达产物的分离操作：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来? 2能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁缺点：??? 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。