药学中的生物技术和方法2015-1-基因工程和干细胞技术.pptVIP

干细胞具有自我更新和多能分化能力， 主要包括胚胎干细胞(ES) 、间充质干细胞(MS)和诱导多能干细胞(iPS)等 iPS由于其在疾病模型及再生医学中的应用能力与胚胎干细胞类似，且不存在伦理问题，逐渐成为这一领域的新星。 干细胞的诱导分化 山中伸弥（Shinya Yamanaka），毕业于大阪市立大学。2006年首次利用4个转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4将小鼠成纤维细胞重编程为胚胎干细胞样的多能干细胞，并验证了其具有与胚胎干细胞类似的多元分化能力和自我更新能力，从而建立小鼠诱导多能干细胞系。2012年，山中伸弥获得诺贝尔生理或医学奖。 诱导多能干细胞iPS iPS：方法和问题 Yamanaka四因子的经典iPS细胞诱导体系： 向体细胞转入4个转录因子Oct4/ Tet1 、Sox2、c-Myc和Klf4 化学小分子iPS细胞诱导体系:丙戊酸、Parnate、 Repsox、FSK、DZNep和CHIR-99021 其中CHIR、FSK和Repsox 能够激活Sall4、Sox2 的表达，而DZNep能激活Oct4 的表达 iPS瓶颈问题 重编程效率低和培育周期长。四因子体系的诱导效率不足1%，化学小分子体系仅~0.05% 免疫原性问题 基因不稳定性问题。iPS中存在着染色体的异常和更多的小突变 致瘤性问题 干细胞技术和药物开发-I：干细胞用于药物筛选和临床前评价 干细胞技术和药物开发-II：病人干细胞 干细胞和药物开发-III：肿瘤干细胞（CSC/TSC） 肿瘤干细胞可通过细胞间通讯诱导正常干细胞向肿瘤干细胞转化 肿瘤干细胞（CSC/TSC）的特征 四个重要特征：1、自我更新的能力；2、多分化潜能；3、高增值能力；4、耐药性 多药耐药（multidrug resistance， MDR）是导致肿瘤治疗失败的主要原因之一。肿瘤干细胞一般处于静止期，高表达ABC外排转运蛋白，使化疗药物在肿瘤干细胞上无效。 白血病干细胞是 表面抗原鉴定：CD133+ 和CD44+ Warning：乳腺癌干细胞表型[CK8+,14+,18+;Vimentin+，EGFR+]与乳腺干细胞表型相同；脑肿瘤干细胞表型[CD133+、musashi-1+、 Sox2+、melk+、 PSP+、 Bmi-1+和nestin+] 与神经干细胞完全一致。 功能学方法鉴定： 细胞微球形成能力 多向分化能力 体内成瘤实验 肿瘤干细胞靶向治疗的思路 思考题 什么是基因克隆？基因库有哪些种？分别有哪些特点？ PCR的原理和应用有哪些？ 单细胞基因组扩增的技术有哪些？原理和特点是什么？ 什么是核酸杂交分析？如何用核酸杂交分析筛选目标基因？ Real-time PCR的原理和技术要点是什么？ 第一代基因测序技术的原理和技术要点是什么？ 什么是合成测序法？其如何实现高通量测序的？ 谢晓亮和乔杰做了什么胚胎植入前遗传诊断技术的工作的？意义是什么？ 单分子基因测序的方法都有哪些？纳米孔测序技术的原理和应用是什么？ 蛋白质组学的技术路线和方法是什么？如何与基因组学研究相呼应？ 基因转染的方法有哪些？技术要点是什么？有哪些应用的风险？ RNAi基因沉默技术的原理和技术要点是什么？目前的方法有哪些？ 如何用PCR技术制备定点突变的基因？ 什么是CRISPR/Cas9基因编辑法？其原理和技术要点是什么？有哪些应用？ 什么是报告基因？绿色荧光蛋白有多少种颜色？在基因展示上有哪些应用？ 如何用报告基因技术研究细胞的信号转导？ 什么是干细胞和肿瘤干细胞？两者又哪些相同和不同的地方？ 什么是iPS？有哪些诱导iPS的方法？目前的技术瓶颈是什么？ 干细胞如何用于药物筛选和临床前评价？ 肿瘤干细胞靶向治疗的原理是什么？有哪些应用？ 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收?到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。 2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增