微生物育种分析.ppt

高产突变是一种数量遗传，是由多基因决定的，产量的提高，需要通过多代诱发突变逐渐积累 诱变是不定向的，会产生各种突变体，从中筛选出复合要求的菌种是诱变育种中一项重要而艰苦的工作 突变的产生，打破了原有的细胞代谢系统，必然引起代谢失调，降低其生存能力，需要注意调整培养基和培养条件，使突变体能生存下来并发挥作用 一代诱变约需2～3个月 突变的机制 碱基置换（转换 颠换） 点突变 移码突变（缺失 添加） 诱变 畸变：缺失、添加、易位、倒位 自发突变 单细胞悬液的制备 1 单细胞、均匀的悬液，可以均匀地接受诱变剂，又可避免长出不纯的菌落 2 菌体要年轻、健壮、同步生长 3 菌悬液制备方法： 细菌：预培养及同步化 孢子：预培养到孢子萌发0.5~1倍孢子长 4 用原生质体作诱变材料 NTG诱变是亚硝基胍，分子式: CH4N4O NTG诱发的突变主要是GC—AT转换,另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失.在自然条件下NTG容易分解,而在酸性(pH5.5)条件下会产生HNO2. 虽然HNO2本身就是诱变剂,但在NTG有活性时(pH6~9),它却无诱变效果.在碱性条件下,NTG会形成重氮甲烷(CH2N2),它是引起致死和突变的主要原因.它的效应很可能是CH2N2对DNA的烷化作用引起的。 羟胺（ HA ）：作用于 C ，使其氨基变成羟基，与 A 配对， G-C e A-T 诱变处理方法1 1 UV诱变 一切操作在红光下或避光进行.取经预培养的孢子悬液8 mL于直径9 cm带搅拌子平皿中，在诱变箱中(提前开紫外灯0.5 h)磁力搅拌，15 W 30 cm照射一定时间.收集于试管中，冰水浴2 h，钝化修复酶.涂布基础培养基分离平板，28 ℃避光培养2~3 d. 诱变处理方法2 2 亚硝基胍（NTG）诱变 于通风橱中准确称量NTG，加助溶剂甲酰胺或丙酮少许（1~2mL）,用pH 6.0磷酸缓冲液溶解成1mg·mL-1，保存于棕色瓶中.NTG不用灭菌，现配现用.采用混合平板涂菌法：先倒好含5~25μg·mL-1 NAG的混合平板,再用预培养好的孢子悬液涂布分离平板，28 ℃避光培养3~4 d. 诱变处理方法3 3 60Co诱变 每支试管中装3 mL用生理盐水稀释到106~107孢子/mL的孢子悬液，整个过程置于装有冰水的烧杯中，照射剂量以处理总剂量计算. 诱变处理方法4 4 UV+LiCl复合诱变 孢子悬液按UV诱变常规处理后涂布于含0.1~1.0% LiCl (W/V)的分离平板上，28 ℃培养3~4 d. 4 突变株的分离与筛选 随机筛选（random selection): 直接从大量随机挑取的突变株中筛选高产菌株 定向筛选/ 理性筛选(rational selection):先设计筛选具有某（些）特性的变异株，再由其中筛选高产突变株 对每代筛选出来的候选菌株都要进行培养基和培养条件优化，因为高产性能总是在一定条件下才能表现出来 筛选培养基和培养条件应尽量和工业生产一致 黄色短杆菌的代谢过程 ? 黄色短杆菌的代谢特点 天冬氨酸激酶（AK），是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys、Thr的协同反馈抑制 协同反馈抑制：该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。 两个分支点的优先合成机制 ： 优先合成Hos，然后再优先合成Met 当Met过量时 阻遏琥珀酰高丝氨酸合成酶，使代谢流向合成Thr的方向进行 当Thr过量时 反馈抑制高丝氨酸脱氢酶，使代谢流向Lys的合成上。（Met＞Thr＞Lys） 育种途径 1.切断或减弱代谢支路 切断或减弱合成Met 、Thr的分支途径——选育营养缺陷型或渗漏突变株 渗漏缺陷型:遗传障碍不完全的突变型，其中某一种酶的活性下降而不是完全丧失，所以这种缺陷型能少量合成某种代谢终产物，能在基本培养基上进行少量的生长。 由于渗漏缺陷型不合成过量的终产物，所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。 A、需要选用HomL（L，leakage） 其意义在于实现优先合成的转换：可引起一种终产物的过量生成。