分子生物学实验技术(聚合酶链式反应)程序介绍.ppt

Content of Table １　定义 ２　技术优点 ３　原理 ４　标准反应体系 ５　反应五要素 ６　热循环条件的选择 ７　反应特点 ８ 常见问题与对策 ９　污染 10 应用 1 定义 在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。 2 技术优点 特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等 PCR product PCR反应曲线 4 标准反应体系 10×扩增缓冲液 10μl 4种dNTP混合物 各200μmol/L 引物 10～100 pmol 模板DNA 0.1～2μg Taq DNA聚合酶 2.5 u （Mg2+） 1.5 mmol/L 加双或三蒸水至 100ul 5 反应五要素 引物 （primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium） 5.1 引物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 引物设计的原则 ①引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右 ②引物扩增跨度：以500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜, ATGC最好随机分布 ④避免引物内或引物间出现二级结构 避免两引物间互补，特别是 3`端 ⑤引物 3`端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基 ⑥引物中可以加上合适的酶切位点 要作酶切时加 ⑦引物的特异性 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 ⑧两引物的Tm值接近 5.2 酶及其浓度 Taq DNA聚合酶 注：无3`→ 5`方向的校正活性 [DNA复制1/109；PCR 出错率1/(2×104)] 一个典型的 PCR 反应约需酶量 2.5 U 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少 5.3 dNTP 的质量与浓度 dNTP使用注意： 1)保存：使用时应配成高浓度，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解； 2)使用量：在PCR反应中，dNTP应为20-200umol/L。 3)成分配比：注意4种dNTP的浓度要相等； 5.4 模板（template） 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一。 5.5 Mg2+浓度 1)Mg2+对扩增特异性和产量有显著影响: Mg2+浓度过高，反应特异性降低；浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶活性，使反应产物减少。 2)在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜； 6 热循环条件的选择 PCR反应条件: 温度 时间 循环次数 6.1 温度与时间的设置 ● 设置变性-退火-延伸三个温度点： 标准反应中采用三温度点法： 1）93-95℃变性； 2）40-60℃退火； 3）70-75℃延伸 ● 对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法， 一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸 ① 变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般93℃～94℃ l min足以使模板DNA变性 ?若低于93℃则需延长时间 ?但温度不能过高，高温环境对酶的活性有影响。 ② 退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有模板的长度 当引物长度为15-20个碱基时，在高离子强度中反应（如1M NaCl） Tm = 4（G+C）＋2（A+T） 复性温度=Tm值 -（5～10℃） ③ 延伸温度与时间： 温度： 一般70～75℃，常用温度为72℃。 时间： 根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min。 6.2 循环次数 ●决定PCR扩增程度 ●主要取决于模板DNA的浓度 ●选在25～40次之间 7 反应特点 7.1 特异性强 靶序列的特异性决定扩增产物的特异性。 在较高的温度下进行，引物结合的特异性大大增加。 7.2 灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数方式增加 从 100 万个细胞中检出一个靶细胞 在细菌学中最小检出率为3个细菌 7.3 简便、快速 在DNA扩增仪中进行变性-退火-延伸反应