第四章酶蛋白的化学修饰详解.pptVIP

Enzyme Engineering酶工程 第三章 酶蛋白的化学修饰 第一节 化学修饰的原理 第二节 化学修饰的方法学 第三节 酶蛋白侧链基团的修饰 第四节 酶的亲和修饰 第五节 酶的化学交联 第六节 酶化学修饰的应用 第一节 化学修饰的原理 一、 酶的化学修饰原因 1． 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。 2． 作用的最适条件不符。 3． 酶的主要动力学性质的不适应。 4． 临床应用的特殊要求。 二、定义 酶分子的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，以达 到改构和改性的目的。即在体外将酶分子通过人工的方法与一 些化学基团(物质)，特别是具有生物相容性的物质，进行共价 连接，从而改变酶的结构和性质。这种物质被称为修饰试剂。 化学修饰酶主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。 三、酶化学修饰的基本原理 1． 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2． 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 3． 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4． 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 影响酶化学修饰反应进程的因素主要有两个： 酶蛋白功能基的反应性 修饰剂的反应性 影响酶化学修饰反应进程的因素： 酶蛋白功能基的反应性 微区的极性：是决定基团解离状态的关键因素之一。 氢键效应：蛋白质或其离子通过氢键来维持稳定性。 静电效应：带电基团之间的相互影响造成的。 位阻效应：当烷基在空间上紧靠着蛋白的功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这时会出现位阻效应。 酶蛋白功能基的超反应性：蛋白质的某个侧链基团与 个别试剂能发生非常迅速的反应。但不一定是酶的活 性部位基团。 影响酶化学修饰反应进程的因素： 修饰剂的反应性 选择吸附 ：修饰剂根据各自特点，选择性地吸附在低极性区域或高极性区，形成蛋白质－修饰剂复合物。 静电相互作用：带电修饰剂可以选择性地吸引在蛋白质表面带相反电荷的部位。(碘乙酸和碘乙酰胺烷基化的速度) 位阻因素：位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。(α－溴代酸的大小影响修饰） 催化因素：不同的修饰剂，其反应速度和反应部位有明显差异，较大程度上与酶的酸碱催化有关。 局部环境的极性：大多反应会与溶剂的极性有关，且溶剂效应相当复杂。 第二节 化学修饰的方法学 一、 修饰剂的要求 二、 反应条件的选择 三、 酶性质的了解 四、 酶修饰方法 一、 修饰剂的要求 1． 修饰剂的分子大小、修饰剂链的长度对蛋 白质的吸附性。 2． 修饰剂上反应基团的数目及位置。 3． 修饰剂上反应基团的活化方法与条件。 在酶蛋白不变性的条件下有选择性地与氨基酸残基反应，易分离修饰后的衍生物以便进行测定。 二、 反应条件的选择 反应条件应尽可能保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进行。 ——避免不可逆变性、有利于专一性修饰蛋白 1． 反应体系中酶与修饰剂的分子比例。 酶与修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰程度。 2． 反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件。 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由 于它们的解离状态不同，反应性能也不同。 3． 反应温度及时间。 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非 专一性的修饰反应。 三、 酶性质的了解 1． 酶活性部位情况。 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大 小、性状、亚基数等。 2． 酶的稳定条件、酶反应最适条件。 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、 抑制剂等。 3． 酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等。 修饰酶的性质及特点 热稳定性 抗原性 体内半衰期 酶学性质的改变 最适pH 对组织的分布能力变化 热稳定性 热稳定性增加 修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强了酶的热稳定性。 增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活。 体内半衰期 体内半衰期延长 酶学性质的改变 绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没有改变，但有些酶在修饰后，米氏常数会增大。 对组织的分布能力变化 对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收。 四、 酶修饰方法 酶分子侧链基团的化学修饰 有机大分子对酶的化学修饰 蛋白质类及其他对酶的化学修饰 第三节 酶蛋白侧链的修饰 一、几种重要的修饰反应 酰化反应 烷基化反应 氧化和还原反应 芳香环取代反应 二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 三、研究新热点 一、几种重要的修饰反应 1．酰化及其相关反应 2．烷基化反应 3．氧化和还原反应 4．芳香环取代反应 二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 3．羧基的化学修饰 三、研究热点-核酸类酶的修饰 RNA酶的侧链基团：