生物制药工艺学凝胶层析.pptVIP

* （二）洗脱与收集 1、洗脱剂。 2、流速（操作压、型号、粒度）。 3、分部收集器。 * （三）凝胶柱的再生 反冲 重新装柱 * 四、主要参数测算 V0及Vi的测算 Kd及Kav的值 分辨率R * （一）V0及Vi的测算 1．重量法 Vt=Vo+Vi+Vg =π/4·d2h Vi=g·Wr Vo=Vt－（Vi+Vg） Vg估算为1cm3/g干胶。 2．过柱法 已知物质的洗脱体积 Ve=Vo+KdVi 如用全渗入（Kd=1）或全排阻（Kd=0）的物质过柱，测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的V0值及Vi值。 常用蓝色葡聚糖（Kd=0）及重铬酸钾（Kd=1）。 * （二）分配系数测定 分配系数 当测得某物质的Ve及Vt ，内水体积Vi及外水体积V0时，算出Kd及Kav的值。 Kd及Kav Ve被认为是一种组分对于某一个凝胶柱的特征常数。 * （三）分辨率 凝胶层析中，两物质（A和B）和分辨率（R）定义为： 当R值＞1，两物质完全分开，小于1时则不能完全分离。 分离时较大柱床体积可增大△Ve 。 减少（WA+WB）的方法是适当浓缩样品、选用小粒度凝胶、流速适当减慢等。 * 用凝胶柱分离A、B两物质，得如下洗脱曲线，请计算其分辨率 * 五、凝胶层析的扩展 （一）上行凝胶层析  利用流动和重力方向相反的上行层析法，即洗脱液向上流动的层析法。 反转柱 （二）增加有效床高 -提高分辨率 （1）串联层析 ：有效柱长 （2）循环层析：即在同一根或两根柱上，样品反复进行层析。 * 循环层析－分级分离 图7.21 人血浆蓝蛋白的循环层析分离 柱：交联葡聚糖凝胶G-100，3.2×93cm；样品：5.2ml（3%）；流速：20ml/h； 洗脱液：0.1mol/L pH8.0 Tris缓冲液（含0.5mol/L NaCl） ? 简单的循环层析装置 选择阀用于选择待循环液或废液，样品从A→D上柱，经B→D洗脱，经检出的废液由E→C排出， 需循环的物质由E→D进入层析柱。 * （三）薄层凝胶层析 用交联葡聚糖作为薄层层析的支撑载体，称“薄层凝胶层析”。 仅适用于分析 。 特点：? 生化分析； 设备简单，操作方便，分离迅速； 分辨率高； 同一薄板可同时分析数个样品； * 第四节 色谱峰变宽的问题 样品的洗脱曲线不是一个窄的矩形峰，而是一个较宽的高斯峰。 洗脱曲线： 样品的分子量分布 仪器造成的峰加宽效应。 * 一、溶液通过色谱柱造成的峰加宽 Giddings提出的无规则行走模型。 溶质分子本身的运动是无规则的。 （一）分子扩散 （二）涡流扩散 （三）流动相中传质阻力 （三）固定相中传质阻力 * （一）分子扩散 浓度梯度 (HETP)d=2γDm/V （HETP）d—溶质分子纵向扩散对塔板高度的贡献 γ—扰动因子，表示柱内填料对于溶质分子扩散的扰动作用。 Dm—是溶质分子在流动相中的扩散系数；V—流速。 (1)小而均匀的填料(γ) (2)适当的溶剂 (3) 提高流速 * （二）涡流扩散 与填料颗粒的形状，尤其是颗粒尺寸有关。 (HETP)e=2λdp dp—填料颗粒的直径； λ—是与填料及装填有关的常数。 (1)小而均匀的填料(dp ) (2)粒度一致且装得均匀(λ) * （三）流动相中传质阻力 流动相在柱中的流速是不均匀的。 溶质分子有流速的梯度而导致溶质分子的浓度梯度，径向扩散。 （HETP）m=ωd2pV/Dm (1)填料装得规整、紧密；(ω) (2) 采用粒度小的填料； (3)降低流速； (4) 选用合适的溶剂（溶质的扩散系数较大）。 * （四）固定相中传质阻力 在色谱柱中溶质分子的一部分F在流动相中，而另一部分（1—F）在固定相中。 分子从固定相中脱离出来到流动相中去，而另一些分子则从流动相进入固定相中。 结果： （1）溶质层变宽； （2）溶质层作为一个整体以FV的速度运动。 * 色谱柱内造成的峰加宽 填充介质粒度越小,峰加宽效应越小。 流速 * 溶液在柱外产生的峰加宽 （一）连接管路 当液体流经细管时，径向速度梯度使矩形溶液脉冲变成抛物面形，并导致浓度的径向梯度。 减小管径 （二）检测池 * 二、峰宽的表示方法 W是峰宽，它是通过曲线的两个拐点的切线和基线交点之间的距离。