CIMT促进脑缺血大鼠神经功能康复的分子机制的研究.pptVIP

强制性运动疗法促进脑缺血大鼠神经功能康复分子机制的研究 张 璇 济宁市第一人民医院 前 言 脑梗死 ( cerebral infarction) 是一种发病率、死亡率和致残率均较高的疾病，给家庭和社会带来了巨大的经济和精神负担。虽然超早期溶栓治疗效果好 ，但大部分病人受时间窗限制而失去了溶栓时机 ，神经功能缺失不可避免，总会遗留不同程度的神经功能障碍，如偏瘫、失语等。由于神经系统具有很强的可塑性，后期的神经功能康复显得非常重要。 强制性运动疗法 （congstraint-induced movement therapy CIMT）是以中枢神经系统可塑性为基础，发展起来的一种康复治疗技术。 CIMT的基本概念是在生活环境中通过限制患者使用健侧肢体，达到强制反复使用和强化训练患肢为目的的疗法。 神经影像学研究及临床应用研究均显示CIMT有显著促进神经功能康复的作用。 但其确切的作用机制还不十分清晰。 立题目的和意义 探讨CIMT促进脑缺血大鼠神经功能康复的分子机制 ，从而为临床该疗法的广泛应用推广提供理论指导。 材料与方法 1．材料 1.1实验动物 120只SD大鼠，体重（260±50）g，雌雄不拘，实验期间定期检测大鼠心率、血压、呼吸并维持于正常范围。大鼠术前12h禁食，自由饮水。 1.2分组与用药 实验分CIMT治疗组，局灶脑缺血模型对照组及假手术组。各组均40只SD大鼠。 1.3 动物模型制备： 大鼠自体血栓栓塞大脑中动脉局灶脑缺血模型的制备，选用SD大鼠，体重230～350g, 用大鼠自体血制成直径为0.35mm的血栓，切成1.5～2mm长，用麻醉导管将5～8个栓子注入一侧颈内动脉，使其堵塞大脑中动脉起始部，建立大脑中动脉闭塞局灶脑缺血模型。假手术组只分离血管不注入血栓 1.4 强制性使用运动疗法干预 80只脑缺血模型成功大鼠，1W时给予进行神经功能缺损评分，随机分2组（即对照组和CIMT组），CIMT组大鼠用 10%水合氯醛麻醉，将健康的一侧前肢置于自然屈曲位置，用手术缝线将皮肤缝在一段3 厘米长的铁丝上（铁丝尾端与绕在胸部的铁环相连），然后用石膏缠绕固定该肢体，部分限制其肢体活动，固定后仍饲养于原笼中。手术后第 8W解除固定。 1.5 标本采集与处理 1.5.1 石蜡切片制备： 每组在1W、2W、4W、8W各时间点，分别随机取2只大鼠，局部麻醉后经2.5%的戊二醛固定后，断头取脑。用锋利刀于病灶边缘取脑组织（各标本取材部位大致相同），0.5～1mm3的3小块。经再固定、梯度酒精脱水、丙酮、环氧丙烷、环氧树脂包埋后，进行超薄切片。 1.5.2 电镜超薄切片制备 ： 每组在1W、2W、4W、8W各时间点，分别随机取2只大鼠，局部麻醉后经2.5%的戊二醛固定后，断头取脑。用锋利刀片于病灶边缘取脑组织（各标本取材部位大致相同）0.5～1mm3的3小块。经戊二醛再固定、梯度酒精脱水、丙酮、环氧丙烷浸透、环氧树脂包埋后，进行超薄切片 1.5.3 免疫印迹脑组织取材 每组在1W、2W、4W、8W各时间点，分别随机取3只大鼠，局部麻醉后经以 4℃生理盐水进行灌洗，断头取脑，迅速取缺血侧大脑皮层及缺血灶边缘各200mg 脑组织备用 2 .各种指标的检测与观察 2.1 神经功能缺损评分 每组在1W、2W、4W、8W各时间点进行神经功能缺损评分，参照改良的Bederson氏6级评分标准 进行评分。 2.3实验指标检测方法 NgR、BDNF、GAP-43和SYPmRNA的表达用原位杂交技术检测。 NgR、BDNF蛋白的表达用免疫印迹（westernblot）方法观察 GAP-43和SYP表达用免疫组化方法观察 2.3.1原位杂交及免疫组化结果观察 原位杂交及免疫组化结果，经常规染色、封片后，自然晾干，结果在40倍物镜下观察每张切片阳性细胞表达，经td2000图像处理系统分析处理，采集图像输入计算机，,以灰度计算所选视野阳性染色的单位面积(阳性细胞的的面积占所选整个视野面积的百分比),每张切片取梗死灶边缘区互不重叠的5个视野，其均值即为该标本每个高倍镜视野中阳性细胞的单位面积。 2.3.2免疫印迹结果分析 采用2200 凝胶图像分析仪，于可见光下采集底片上的蛋白条带图像，通过与相应 β-actin 条带密度比较，计算每个条带密度相对值。 2.4 统计学方法 数据采用均数±标准差（s）表示，运用spss10.0 统计学软件包分析，采用单因素方差分析one–Way–ANOVY方法统计，其中两两比较采用Student-Newman-keuls方法，显著性水平为0.05。 3.结 果 3.1 CIMT对大鼠脑缺血后神经功能缺损的影响 大鼠脑缺血模型术后7d，CIMT组和对照组Bederson评