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第二章 荧光光谱与荧光信号采集处理 光致发光： 利用光源激发而产生，荧光和磷光均为光致发光. 激发光(EXCITATION)： 能特异性地激发某种荧光的一定波长范围内的光线称为该荧光的激发光。 激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长) 发射光谱： 又称荧光发射光谱，反映荧光物质的荧光发射强度与发射光波长之间相互关系的光谱曲线。 实质： 反映了所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。 二者关系: 物质发生电子从基态向激发态跃迁过程中吸收的能量，要高于荧光发射的能量，因此，荧光的波长要大于激发光的波长，两者的差值称为 Stokes shift（斯托克斯位移）。 2.荧光的淬灭 由于各种原因，使荧光探针的荧光强度降低的现象称为荧光淬灭。 能引起荧光强度降低的物质称为淬灭剂。 3.荧光探针： 能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）。 荧光探针的发展非常迅速，目前仅美国 Molecular Probes公司就可提供1800多种荧光探 针，每年该公司还不断推出新的荧光探针。通 常每种被测物质都有几种或几十种特异的荧光 探针。 选择合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实验结果的保障。 1.根据实验目的及所要检测的指标  实验中选择使用何种荧光探针是由实验目的决定的，如待测心肌细胞内的钙离子 选择范围就限定为标记活细胞钙离子的探针等。 商品探针价目 Probes for Proteins FITC 488 525 PE 488 575 APC 630 650 PerCP? 488 680 Cascade Blue 360 450 Coumerin-phalloidin 350 450 Texas Red? 610 630 Tetramethylrhodamine-amines 550 575 CY3 (indotrimethinecyanines) 540 575 CY5 (indopentamethinecyanines) 640 670 2. 考察荧光探针的特异性和毒性 考察的荧光特性包括： ①荧光探针与样品的反应性： 选择性或专一性； 探针的跨膜特性；如标记核的探针AO/ PI 反应条件（浓度、温度、pH值、作用时间、反 应介质）； 荧光探针是否对样品有毒副作用等干扰。 荧光强度应用－细胞毒性 ② 荧光探针的灵敏度及荧光强度 光吸收效率（摩尔消光系数）和荧光量子产率能反映探针灵敏度及强度。在选择时，尽量挑选这两个数值高的探针。 ③ 荧光探针标记后样品的光谱特性 ④ 了解探针的稳定性和光漂白性 对光照、荧光物质的浓度、探针所在的介质、温度的稳定性等。 ⑤ 样品中 之间的相互影响 样品中多重荧光之间的相互影响主要表现为光谱交叉（窜色）。 光谱交叉 荧光光谱拆分 3.考察荧光探针与所用共聚焦系统的匹配情况 主要指：二者的激发波长要匹配；仪器的性能能否达到实验要求，如扫描速度能否检测到荧光信号的快速变化等。 常用荧光探针举例 4.荧光图像的采集、处理与定量测定 可实现如下图像采集功能： 1) 单独采集荧光或光学图像; 2) 分通道同时采集多重荧光图像和透射光图像，并通过叠加使之同时展示在一幅画面上；  3)可完成断层扫描、三维重建、时间动态实时监测及波长扫描等。 4.2 采图方法 逐层采集二维及三维荧光像 高分辨率XY平面 转导GFP的菌丝体 高分辨率XY平面 高分辨率XY平面 高分辨率XY平面 高分辨率XY平面 选择感兴趣的区域（regions ofinterest,ROI) 三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞 三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞 透射光图像 4.3 定量及动态荧光测定 XYZ重建和测量 复习题 1.荧光的概念？荧光有哪些性质？ 2.荧光淬灭外因？ 3.如何选择适宜于自己科