广州大学生物工程下游技术实验(超氧化物歧化酶SOD)教材.docx

PAGE10 / NUMPAGES10 生物工程下游技术实验— “超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术” 姓名： 学号： 指导老师：柯德森； 同组者：； 时间: 摘要： 通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力不断减小，比活力不断上升，总纯化倍数为1.03，活性得率为8.92%。 前言 超氧化物歧化酶(superoxide dsdismutase，SOD)是需氧化物中以超氧阴离子为底物的一种酶，广泛存在于各种生物中。SOD不仅在生物体内对抗氧化、解毒起重要作用，也有延缓机体衰老、抗肿瘤及抗免疫性疾病等功能，因而受到极大关注。 SOD属于金属酶，其理化性质不仅取决于蛋白质部分，而且还取决于结合到活性部位的金属离子。按照结合的不同金属离子，生物体中SOD有Cu、Zn-SOD、Mn-SOD和Fe—sOD三种，但近几年发现低等生物中尚存在含Ni的SOD。在已发现的酶中，超氧化物歧化酶 (SOD)是需氧生物和耐氧生物的体内清除超氧化物自由基的酶超氧 自由基在体内的过多积累将可能引发脂质过氧化损伤DNA，使脱水酶失活，使线粒体中的NADH脱氢酶NADH氧化酶磷酸腺苻酶 (ATPase)失活，从而易引起生物体发疾病或衰老。 自从1968年McCord与Fridovich发现 SOD及其催化超氧化物自由基歧化为 O2 与H2O以来，SOD一直以來被认为是生物体内最重要的抗氧化酶。根据近10年的研究报告表明，SOD具有清除超氧化物自由基，防止其对机体直接或间接的损伤；使O2成为细胞内自由基的排污漕；调节机体内O 的水平；调节机体内NO水 和催化反应产物H2 O2等作用。现在在日常生产应用中，多以动物血液中提取SOD。但是动物血液中的疾病很多，价格也比较昂贵。从植物中提取SOD就可以相应的解决上述问题，类似绿豆芽这种植物，其成本低廉，且SOD的含量丰富，又无污染，将其大量应用于生产有着很好的发展前景。 本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。 二、实验材料与方法： 一材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用。 二试剂:葡聚糖（sephadexG-100或G150）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000, 考马斯蓝G250 , 磷酸 ，乙醇（AP） ， 牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), 甲硫氨酸( methionine) , NBT（氮兰四唑 Nitroblue Tetrazdinna）, 核黄素 , EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）, 三仪器: 离心机 WFZ-UV2000 型紫外分光光度计 201×7（717）强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂 匀浆机、各型号烧杯、试管、量筒、带毛塞试管、漏斗、移液枪、 移液管、玻璃棒等 四实验方法和步骤： 1．材料处理和取样 1）．25g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，加入250 ml pH7 0.05 mol/L pb液，匀浆机匀浆，二层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量样为样①，进行SOD活性测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr） 2）．实验流程： 称量25g 绿豆+250ml pH7 0.05 mol/L pb液，匀浆，两层纱布过滤，离心（3000rpm）15Min 取清液，取少量样为样①，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。 所得清液测量总体积，缓慢40％饱和（NH4）2SO4 至浓度为19.4g/100ml，4℃冰箱静置分层。 离心（3000rpm） 取清液，取少量为样②，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。 步骤3中的清液缓慢加入硫酸铵至75%饱和度（8.7g/100ml）（过程充分搅拌），5℃至分层，离心（3000rpm） 取沉淀，取样③，计算SOD总活性单位及活性单位。 装入透析袋中，于蒸馏水中5℃透析过夜。 透析后溶液用滤纸过滤得清液，重新装入透析袋中用PEG浓缩。 装柱：1）排气泡 加蒸馏水 留15％体积水 2）100mL G100 一次装完 3）静置10min 打开出液口 排