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第三章 细胞免疫功能测定 第一节 淋巴细胞计数和亚群测定 淋巴细胞各亚群细胞的膜表面均具有可供鉴别的特殊结构，即表面标志。应用化学方法可检测淋巴细胞在不同发育阶段所含酶种类及含量的差异。检测外周血中各类淋巴细胞及其亚群的数量，这对了解机体的免疫功能状态，研究某些疾病发病机制及辅助临床诊断具有一定的意义。 （一） E花结试验 人类T细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，称E受体。该受体在体外与SRBC结合，从而形成玫瑰花结样细胞团，可用来计数T细胞。 1、试验方法： 外周血淋巴细胞：2×106／m1 SRBC：2×108／m1 各取0.1m1在试管中混匀，置37℃水浴温育5min，1000r／min离心5min，4℃冰箱放置2h后取出。轻轻吸去大部分上清，旋转试管使细胞重悬，取一滴细胞悬液于载玻片上，甲苯胺蓝染色后镜检，结合3个以上SRBC的淋巴细胞为E花结形成细胞，即T细胞。计数200个淋巴细胞后计算T细胞的百分率。 2、正常参考值：60％一80％ 3、意义：有助于细胞免疫缺陷性疾病的诊断和疗效观察，有助于对恶性肿瘤、严重病毒或真菌感染、活动期自身免疫疾病患者的疗效观察和预后判断。 （二）活性E(Ea)花结试验 部分T淋巴细胞与较低比例SRBC混合，经低速离心沉淀后，需在低温共同培育，即能迅速形成E花结，故称为活性E花结形成细胞。现认为此类细胞对SRBC具有高度亲和力的T细胞亚群，它能更敏感地反映细胞免疫的水平和动态的变化。 1、试验方法：同E花结试验基本相同，只是省去4℃冰箱放置2h一步。 2、正常参考值：15％一20％ 3、意义：临床上用于评价癌症、免疫缺陷病、迟发型变态反应、某些感染和组织器官移植时人体细胞免疫状况以及判断预后，并用于考核药物疗效，研究药物作用机制等。 （三）稳定性E花结试验 在E花结试验中，如将形成的E花结在37℃放置30min，绝大多数会快速解离，但有极少数振荡后仍不解离，称为稳定性E花结(Es花结)。 1、试验方法：按E花结试验操作形成E花结后，在37℃放置30min，计数Es花结形率。 2、正常参考值：1.5％一5.1％ 3、意义：Es花结的形成，是T细胞被激活的结果，是活化T细胞的一个标志，可反映T细胞的功能，有助于了解细胞免疫的状态，在慢性活动性肝炎、急性淋巴细胞血病、淋巴瘤、肝癌、妇科肿瘤等疾病中可显著升高。 （四）29℃E花结试验 E花结试验的结果与温度密切相关，据实验推测，29℃条件下，某疾病患者T细胞SRBC受体密度、亲和力有所改变，从而提出29℃E花结试验。据实验推测，29℃条件下，某疾病患者T细胞SRBC受体密度、亲和力有所改变，从而提出29℃E花结试验。 1、试验方法：淋巴细胞与SRBC混合后，离心，在29℃中共温1h，同上计数花结形成率 2、正常参考值：49％一59％ 3、意义：在恶性肿瘤、系统性红斑狼疮、病毒感染、肝炎、心肌梗死等患者中29℃E花环形成率可明显降低。 （五）EA花结试验 B细胞： EA花结： Fc受体 EAC花结： C3b受体 检测外周血B EA花结为例） 1、试验方法：取1%鸡或羊红细胞悬液，加等容积的抗血清混合，置37℃水浴温育30min，不时摇动， Hanks液洗涤3次，除去未结合的抗体，配成1%（致敏RBC 2×108／m1）的EA悬液。取0.1ml淋巴细胞悬液与等量的EA悬液混合，置37℃水浴温育30min， 500r／min离心5min，以下同E花结试验。 （2）正常参考值：10%-19% （3）意义：慢性淋巴细胞白血病时可升高，免疫缺陷时降低。 （二）B细胞膜表面 Ig(SmIg)测定：免疫荧光法测定SmIg （1）试验方法：取0.2ml 1-2×105／m1的外周血淋巴细胞，200r／min离心5min，弃上清，加入50ml抗人免疫球蛋白荧光抗体， 40℃反应60 min ，用含1%的BSA的PBS洗涤3次，弃上清，制片，荧光显微镜检查。细胞周边出现线状荧光的淋巴细胞为SmIg细胞，即B淋巴细胞，计算B细胞百分率。 （2）正常值：16%-20% IgG: 4.0%-12.7%; IgA: 1.0%-4.3%; IgM: 6.7%-13.0% （3）意义：同上 （三）淋巴细胞亚群检测 T细胞亚群： Tc: 杀伤性T细胞 Ts：抑制性 T细胞 TDTH: 迟发型超敏反应性T细胞 1、试验方法： （1） 取5×106／m1的外周血单个核细胞悬液； （2） 取0.1ml细胞悬液与0.1ml 相应的CD McAb工作液混合， 4℃静置45 min，洗涤3次，弃上清； （3）加入最适浓度的荧光二抗0.1ml ，混匀， 4℃反应30 min，洗