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液相色谱及其检测技术 李俊玲 2013年8月1日 主要内容 液相色谱基本知识 液相色谱常见故障及维护保养 液相色谱的应用 检测方法前处理技术 报告及数据分析 液质联用技术 1 液相色谱基本知识 1.1 液相色谱的发展 ?20世纪初，俄国植物学家茨维特（Tswett）提出经典液相色谱法。 1938年有了薄层色谱。1944年有了纸色谱。 ?20世纪50年代后，气相色谱迅速发展，液相色谱发展缓慢。 ?20世纪60年代末期，随着微粒固定相的研制成功，及高压输液泵和高灵敏度检测器的出现，高效液相色谱方法在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上建立起来。 ?20世纪70年代，往复式双柱塞恒流泵占主导地位，Kirkland制备出多孔球形硅胶，平均粒径7μm。 ?20世纪80年代，研制出二极管阵列紫外吸收检测器。 ?20世纪90年代，HPLC高速发展，联用技术，多维色谱成为活跃的新技术领域。 ?2000年后，亚二微米填料（色谱柱50mm），高分离度快速（超高效）液相色谱提高了分析的速度。 早期的柱色谱 1.2高效液相色谱的组成 什么是高效液相色谱(HPLC) 高效液相色谱的定义为： 高压泵驱动液体(流动相) 通过装填有涂层颗粒的柱管(色谱柱)将混合物分离为单一组分的色谱分离技术。 HPLC的主要组成部分 溶剂输送系统(泵) 溶剂–流动相 进样器(进样阀) 色谱柱–固定相 检测器 数据系统 HPLC的特点 .高压：系统压力10-40MPa；(1 MPa = 10 bar =147psi) .高速：分析时间短,仅几分钟到几十分钟； .高效：柱效高为5000-30,000塔板数/m .高选择性：适于复杂、多组分样品的分离 .高灵敏度：最低检测线（LOD） UVD 10-9g; FLD 10-12g；RID 10-6g； 液相色谱仪各个模块 　 液相色谱仪由输液系统，进样系统，分离系 统，检测系统和记录数据处理系统五部分组成。 １.2.1 输液系统 　１) 流动相和储液罐 　　　流动相－有机溶剂，纯水，缓冲盐溶液等 　　　储液罐－玻璃，不锈钢，塑料容器，0.5L -4L 连接管路－塑料管，配有不锈钢或玻璃过滤器， 　　　　　　　　孔径为0.45?m左右。 图片 液相色谱仪各个模块 2） 输液泵 　A.　对泵的要求 　 a) 泵要耐腐蚀，一般采用不锈钢材料制成， 　　b) 在高压下能连续工作，压力一般为 　　　　40-50MPa, 24h工作， 　　c）输出流量范围宽，填充柱：0.1-10（mL/min） 微孔柱：0.01-10(mL/min） d) 流量稳定，流量的控制精度应小于１％。 　　　　　　　　 　　　　　　　　 液相色谱仪各个模块 B.　常用泵 气动放大泵、往复泵、螺旋注射泵、隔膜泵等几种，由于气动放大泵和螺旋注射泵存在流量调节不便、溶剂更换困难、不利于进行梯度洗脱等缺点,应用越来越少。往复式柱塞泵的应用更为普遍 。 a) 恒流泵 如往复泵 　 （１）注射型－通过控制电机转数来改变柱塞移动速度,　操作方便,缺点是液缸容积小,不利于连续工作。 (２）往复型－有并联和串联两种,如安捷伦1100、1200的泵就是双柱塞、往复式串联泵。 　 b) 恒压泵如气动放大泵 　　 是输出压力不变的泵，系统阻力不变时可保持恒定流量，否则流量改变。 液相色谱仪各个模块 3）梯度洗脱装置 　　梯度洗脱是在洗脱过程中，连续或间断的改变流动相中含有的两种或两种以上不同极性溶剂的比例，即调节流动相的极性，使样品中的组分可在最短的时间内达到满意的分离。 　　　实现梯度洗脱，需要二元或多元泵，梯度控制装置及软件。 a 低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。 b 高压梯度 （或称内梯度系统 ）：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱。 气动放大泵（恒压） 往复式柱塞泵（恒流） 液相色谱仪各个模块 1.2.２进样系统 　　定量地将试样注入色谱系统的装置。 　1) 六通阀进样器 　　　耐高压，死体积小，不锈钢材料制成，定量管体积5-10?L。 2) 自动进样器 　　　由计算机控制，按预先编制的进样程序进行，进样量连续可调，重复性好。 液相色谱仪各个模块 　1.2.３分离系统 　　包括色谱柱和柱箱及控温部分 　１）色谱柱 　　　内壁抛光的直型柱管，内装固定相，标准柱长一般为10-50cm，内径4.6mm，微孔柱内径0.5-1.0 mm。　 液相色谱仪各个模块 ２）柱箱及控温部分 　　要求控制柱温的情况： 　a. 标准分析中，