酶的提取与分离纯化剖析.ppt

* 实验设计原理 利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而分离。 pH6.0 pI 6.0 蛋白质带正电 pI 6.0 蛋白质带负电 * 2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程 平衡 吸附 去吸附 分离结束 再生 + 低盐 高盐 利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來 Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- * Ion-exchange chromatography * 3. 操作 平衡 上样 平衡 洗脱 再生 1）上样：上样体积不十分严格。 2）洗脱: 增加溶液的离子强度 梯度洗脱法 改变溶液的pH值 3）再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理。 4.应用 制备纯化生物大分子 * 图4-39 梯度溶液的制备方法和洗脱曲线 （a）线性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）编程梯度 * 影响离子交换层析的主要因素 PH 离子强度 层析介质（流速、分辨率） * （三）疏水层析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 从分离纯化的机制看，属吸附层析类。利用疏水层析介质和蛋白质分子都具有一定的疏水性质 ，根据被分离成分与固定相之间疏水力大小的不同而进行分离。 * 大多数蛋白质具有较强的亲水性，但分子内部存在一个疏水核心， 欲让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些疏水补丁（hydrophobic patch），或让蛋白质发生局部变性（可逆），暴露出掩藏于分子内的疏水性残基。 原理: * 在高盐浓度下，蛋白质发生局部结构可逆改变，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的蛋白质，按其结合力大小，依次进行解吸附。 * * 2. 吸附剂 亲水性（如 Sepharose） 基质 固定相 疏水性（如硅胶、树脂） 配体 （疏水性基团）（苯基、辛基、烷基） * 产品名称 载体 配基 生产公司 Phenyl Sepharose 4FF 琼脂糖凝胶珠 苯基 GE Octyl Sepharose 4FF 琼脂糖凝胶珠 辛基 GE Butyl sepharose 4FF 琼脂糖凝胶珠 丁基 GE 一些商品疏水层析介质 * 3. 操作 1） 加样：样品溶液中补加适量的盐。 2） 洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。 3） 再生：除去固定相吸附的杂质 ，用水或 8mol/L 脲素溶液 。 4. 应用 主要用于分离纯化大分子物质。 * （四）吸附层析（adsorption chromatography） 1. 原理 利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。 * * 吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。 吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选择。 * 2.吸附剂 吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。 1）吸附剂的选择： 根据吸附能力强弱分为： 弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等 强吸附剂：氧化铝、活性炭 * 2）吸附剂的性质： 活性炭：强吸附介质，选择性差，除色素。 硅胶：常用的极性吸附介质，有机小分子吸附。 羟基磷灰石 （HA） [Ca10(PO4)6.(OH)2] : 微晶型的磷酸钙制品，表面有Ca2+和PO43-两种带电基团； 酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。 吸附原理是HA的Ca2+与蛋白质的负电荷基团作用。 分离纯化生物大分子：DNA（不高于10ng/人剂量），Protein * （五）亲和层析(Affinity Chromatography) 由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。 又称： 功能层析（function chromatography） 生物专一吸附（biospecific adsorpt