酶与蛋白质工程固定化酶与固定化细胞剖析.pptVIP

第九讲 固定化酶与固定化细胞 固定化酶的性质 1)选择合适的微载体类型 对细胞在不同微载体上的贴附性能进行评价，计算细胞贴壁率和细胞数,并绘制成曲线,比较细胞容纳量、微载体用量、搅拌速度,由此选出适当的微载体 2)浸泡水化及消毒 在玻璃容器内加入适量的微载体, 加入无Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液(PBS)浸泡3h以上,轻轻搅动。然后加入1/2的新鲜PBS再洗1次。高压蒸汽灭菌 3)接种 根据细胞类型决定接种浓度。微载体的浓度一般按2-3g/L配制,搅拌速度控制在50-70 r/min 4)培养观察与细胞计数 在显微镜下直接观察微载体上细胞的生长情况，将微载体上的细胞消化后计数并计算其浓度 5)传代培养 微载体上分离后的细胞可进一步做微载体传代培养。如果放大培养,可在细胞脱离微载体后，加入一些新的微载体以增加培养体积，也可在微载体长满细胞后直接加入新的微载体进行球传球接种 6)细胞消化与收获 通常采用酶消化法收获细胞。对于回收率要求不高的细胞种类分组沉降简单易行,而若要求高回收率,则可用过滤方法,采用100μm孔径的尼龙网、不锈钢网、多孔玻璃滤器等将细胞与微载体分离开 (2) 吸附法 分物理吸附法和离子交换吸附法 ① 物理吸附法 物理吸附法是将微生物细胞附着于固体载体上的一种固定方法。载体常用的多孔砖、瓷杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纤维等 如，将酵母用聚氯乙烯或多孔砖固定化，每克载体可以固定80mg酵母；也可将固定化的酿酒酵母，装入反应柱，以生产乙醇，乙醇可达120g/L。在环境保护中用木片、石砾等固定微生物细胞作为污水处理的过滤器 物理吸附法载体与微生物细胞间不起反应，吸附量大，但细胞极容易脱落而流失 固定化细胞 ②离子交换吸附法 利用离子交换吸附细胞常用的载体是离子交换树脂 例如，利用阴离子交换树脂吸附放线菌含葡萄糖异构酶含酶菌株； 用Dowea吸附敏捷固氮菌(含多酶)菌株； 用离子交换纤维素吸附无色杆菌(含头孢霉素酰化酶菌株)； 用离子交换纤维素吸附米曲霉含转化酶菌株等获得成功 这种方法制备的固定化细胞，细胞易脱落，需不断补充新细胞 固定化细胞 动植物细胞固定化 植物细胞固定化 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。80年代开始研究，目前一般采用包埋法和吸附法 固定化细胞 包埋法 将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中 Brodelius等(1979)首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞、毛地黄细胞、海巴戟细胞 在Ca2+离子等多价阳离子的存在下，海藻酸盐的羧基和阳离子之间形成离子键。因海藻酸钙不溶于水，在细胞表面形成凝胶 如果采用磷酸、柠檬酸、EDTA等螯合剂处理将Ca2+离子除去，又能使胶体溶解释放出细胞 当海藻酸钙微囊用多聚赖氨酸处理后，使凝胶微球表面成膜，不会再被螯合剂溶解。再用柠檬酸去除钙离子，球内海藻酸钠成液态，细胞悬浮在微囊内 海藻酸盐—多聚赖氨酸微囊化 固定化细胞 植物细胞微囊化示意图 固定化细胞 吸附法 将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内,或吸附于中空纤维外壁上 如,将植物细胞定置在中空纤维的外壁与容器内壁之间，培养液及O2在中空维管内流动，透过中空纤维管壁(具半透膜性)，传递给附着于外壁的细胞，细胞代谢产物亦透过外壁随管内培养液流出。利用此法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化合物的研究，可连续使用1个多月 如,将洗净、灭茵后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中，振荡培养一 段时间，细胞吸附于塑料孔洞内，并能生长繁殖 固定化细胞 动物细胞固定化 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩，需要最温和的固定化方法。目前，动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多 吸附法 由于大多数动物细胞属于附着细胞，在培养过程中趋向于附着固体表面。因此，吸附法特别适合于制备固定化动物细胞 主要载体及固定方法有： (1) 转瓶法 转瓶是由玻璃或塑料制成。其表面经一定处理而带有电荷，如用高锰酸钾等氧化剂，强酸、强碱或紫外辐射等表而处理，可使动物细胞附着于表面，转瓶以一定旋转速度进行培养.若在转瓶内增大表面积，可提高生产能力 固定化细胞 (2) 微载体法 微载体是指直径为100-200um，相对密度接近于1.0的颗粒固定化载体。由表面带有电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。微载体具有较大的表面，对细胞生长和物质传递特别有利，但强度不够．易破碎，使用时间较短，已用于固定多种细胞。如用于生产干扰素、人纤溶酶原活化剂白细胞介素及各种疫苗的