流式细胞技术剖析.pptVIP

用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。 二维等高图 三参数直方图 三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。 一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。 多参数分析 Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。 根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。 门（Gate）设置 A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞 A、B、C均为任意门 区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。 Region设置 D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3- D4 CD4- /CD3+ 如十字门分析时，就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。 样本制备：单细胞悬液 标记染色：光谱不重叠 阴性对照的设置：检测标本的重复性 质量控制 二、流式细胞仪免疫分析的技术要求 外周血淋巴细胞样品的制备：淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。Ficoll，40kd，高密度，低渗透压，无毒性。（比重为1.0177±0.001的分层液) 样本制备 利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图。 培养细胞的样品制备：单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。 酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。 化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。 表面活性剂处理法：Triton-x100、皂素等。 防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法： 1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。 2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。 3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞表面荧光染色分析不受影响。 单细胞悬液的保存 适用条件: 有较高的量子产额和消光系数 对488nm的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 常用的荧光染料与标记染色 FITC Texas red PE.PC.APC PEcy5 FL1 FL2 FL3 FL4 激光 细胞悬液 异硫氰酸荧光素 得州红 能量传递复合染料 藻胆蛋白类 几种常见的荧光染料 名称 染料 激发波长 荧光颜色 溶解性 对PH敏感性 特点 异硫氰酸荧光素 FITC 488 绿 525 易 敏感 易溶于水，与抗体结合不影响特异性 得州红 Texas red 568 红 615 不易 不敏感 稳定，偶联后量子产额低 藻红蛋白 PE 488 橙 575 易 不敏感 具较多发光基团，消光系数和量子产额高 藻青蛋白 PC 488 别藻青蛋白 APC 633 红 670 能量传递复合染料 PEcy5 488 红 670 易 不敏感 减少交叉，成本高 常用的几类荧光染料 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。 能量传递复合染料 Laser 488nm PE CY5 CY5 CY5 488nm 575nm 670nm 红色荧光 花青苷5 藻红蛋白 能量传递复合染料机制 荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记： 免疫荧光标记 FITC+PE 488 525 、575 绿色、橙色 FITC+T red 488 525 绿色 568 615 红色 FITC+PeCy5 488