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分子生物学 添加时间：2008.10.29 | 作者：admin 实验一 仪器介绍和实验规范训练及实验准备 一、实验目的 1. 系统回顾分子生物学实验技术的发展。 2. 了解分子生物学——特别是关于分子克隆的实验方法和理论、了解分子生物学实验安全规则和注意事项。 3. 掌握分子生物学实验所用试剂的配制过程。 二、实验内容 1. 分子生物学实验的条件与设施 , 包括各种仪器设备、房屋设置等； 2. 分子克隆的常规实验方法和理论； 3. 分子生物学实验安全规则和注意事项； 4. 配制近期实验所需要的公共试剂。 三、实验所需仪器设备 1. 多媒体设备 2. 实验所需仪器 37 培养箱、温控空气摇床、温控水浴摇床、超净工作台( 双人双面)、电子天平、双蒸水器、高压锅、磁力搅拌器、移液枪、振荡器、-20冰箱、制冰机、 -70冰箱、高温烘箱、离心管、枪头、烧杯、量筒等。 3. 实验药品 氯化钠、氢氧化钠、 Tris 碱、琼脂糖、盐酸、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉、SDS 、 EDTA 、无水乙醇、 95% 乙醇、低熔点琼脂糖。 四、注意事项 1. 高压蒸气灭菌 （1）紧盖和开盖时，都应采用对角式均匀地转动紧固螺栓，并且双手同时 操作。切不可采用将紧固螺栓逐个拧紧或松开的方法。 （2）灭菌结束以后，切勿过早打开排气阀，否则，开盖时试管内的培养基 会由于内外压力不平衡而冲出管口，使棉塞上沾染培养基而发生污染。 2. 紫外线防护 在操作紫外装置时，注意自我防护，避免直接接触紫外线，以防灼伤皮肤或眼睛。 实验二 家蚕基因组DNA提取及检测 一、实验目的 1. 了解并掌握苯酚法提取动物基因组 DNA 的原理和步骤。 2. 了解DNA 浓度和质量测定的技术。 二、实验原理 酚、氯仿是蛋白质变性剂，能有效出去核蛋白，使核酸从核蛋白复合体中分离出来。氯仿还能加速有机相与液相的分层，少许异戊醇能稳定界面，减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。 三、实验材料、试剂和设备 1. 实验材料和试剂 材料：家蚕蛹 试剂：液氮、平衡酚（Tris饱和）、1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）、0.5 mol/L EDTA （pH 8.0）、 TE（PH8.0）、10mol/L CH3COONH4 、70%乙醇、20mg/ml Proteinase K、10mg/ml RNA酶。 抽提缓冲液： 10 m mol/L Tris-Cl（pH8.0） 0.1 mol/L EDTA （pH 8.0） 0.5% SDS 加样缓冲液： 0.25%溴酚蓝；0.25%二甲苯青（FF）； 15%聚蔗糖水溶液 2. 实验仪器 冷冻离心机、常温离心机、电泳仪、核酸电泳槽、核酸蛋白定量仪、37培养箱、温控水浴摇床等。 四、操作步骤 1. 将家蚕蛹放入预冷的研钵中，加入液氮后快速研磨成粉末状；加入1mL的抽提缓冲液，轻轻摇匀，形成匀浆状，将匀浆液转至5mL无菌离心管中；再用1mL的抽提缓冲液清洗研钵，并将洗液转入同样的离心管中，然后加入蛋白酶K至终浓度100μg/mL，52水浴保温5h或过夜； 2. 加入等体积平衡酚，温和振荡，摇匀15 min（置-20，5-10 min）；4 12000 rpm离心10 min，将粘稠的上清液转移到离心管中； 3. 再用酚﹕氯仿（1﹕1），氯仿各抽提一次10 min，然后412000rpm离心10 min； 4. 移出上层水相，加入2-2.5体积冰冻乙醇，转动离心管使溶液充分混合，DNA立即形成沉淀；4，7000 rpm离心10 min或用高压灭菌过的玻璃棒/消毒牙签将DNA沉淀从乙醇溶液中移出； 5. 用70%的乙醇洗涤DNA沉淀2次，晾干后，加入350 μL TE（pH8.0），并加入RNAase使终浓度为50 μg/mL，在37培育4h； 6. 将DNA转移到1.5mL的无菌离心管中，再加入TE（pH 8.0）350 μL到5mL无菌离心管中洗涤，并将洗液转入同样的1.5mL离心管中； 7. 再用等体积的酚，酚：氯仿（1﹕1），氯仿各抽提一次，然后加入2-2.5体积冰冻乙醇，转动离心管使溶液充分混合，DNA立即形成沉淀； 8. 用70%的乙醇洗涤DNA沉淀2次，后晾干，加入TE 200 μL溶解DNA； 9. 取DNA 4μL与2μL 含有0.3%Goldview染料的6×上样缓冲液混匀，放置5min后，点样到0.8%琼脂糖凝胶中，以 2.5--5 v/cm电泳； 10. 紫外灯下观察拍照； 11. 取2μL DNA溶液，用98μLTE稀释50倍，然后用分光度计检测DNA的浓度和纯度。 注：第9、10、11步将在实验三中详细讲解。 实验三 基因组DNA的检测 一、实验目的 1. 掌握基因组DNA检测方法。 2. 了解不同类型凝胶电泳的适用范围。 二、实