NY_T2743-2015甘蔗白色条纹病菌检验检疫技术规程实时荧光定量PCR法.docVIP

ICS 65.020 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2743—2015 甘蔗白色条纹病菌检验检疫技术规程实时 荧光定量PCR法 Technical regulations for inspection and quarantine of Xanthomonas albilineans (Ashby)Dowson—Real time PCR method 2015-05-21 发布 2015-08-01 实施 中华人民共和国农业部发布 —1— 刖 吕 本标准按照GB/T 1. 1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)归口。 本标准起草单位:农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室、农业部甘蔗及制品质量监督检验 测试中心、国家甘蔗工程技术研究中心。 本标准主要起草人:许莉萍、王恒波、阙友雄、黄国强、郭晋隆、苏亚春。 甘蔗白色条纹病菌检验检疫技术规程实时荧光定量PCR法 1范围 本标准规定了甘蔗白色条纹病菌实时荧光定量PCR检测方法。 本标准适用于甘蔗种茎、种苗以及甘蔗或其他植物组织中的甘蔗白色条纹病菌(Xa加/u^omsaZ- 况/mmM)的检验检疫与检测。本标准中PCR等缩略语参见附录A。甘蔗白色条纹病菌有关信息参见 附录B。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/ T 28067甘蔗黄叶病毒实时荧光RT - PCR检测方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ftrpB 基因 forpBgene 植物病原细菌的一种过敏性反应和致病性基因（hypersensitive reaction and pathogenicity gene, 参与和介导过敏性反应(hypersensitive response，HR)的发生，与植物病原细菌致病性密切相关。 ArpB基因是甘蔗白色条纹病菌的特异致病基因，编码细菌的类型m蛋白分泌系统(type I protein secretion system，TTSS) ，通过该分泌途径，将细菌产生的诱导植物致病的蛋白 ，释放至!J 胞夕卜或宿主细胞 中，从而诱发宿主的各种效应。 4原理 利用荧光信号伴随着目标序列PCR扩增产物的增加而增强的原理，通过收集PCR扩增过程的荧 光信号值，即可判断试样是否带有目标序列。为此，在克隆甘蔗白色条纹病菌特异性致病基因全 长序列基础上，根据序列信息设计了 PCR引物与探针，筛选获得特异性引物与探针，建立了一种基于 基因检测甘蔗白色条纹病菌的实时荧光定量PCR方法。 5试剂 除非另有规定，在分析中仅使用分析纯试剂，实验用水符合GB/T 6682的二级水指标，其中涉及 PCR的用水要求达到一级水指标。 1氢氧化钠(l〇mol/L)溶液:在160mL水中加人80gNaOH，溶解后加水定容至200mL,塑料瓶中 保存。 EDTA溶液(500 mmol/L,pH 8.0):称取二水乙二铵四乙酸二钠（Na2EDTA . 2H20)18. 6 g，加 人70 mL水中，加热至完全溶解后，冷却至室温，用10 mol/L NaOH溶液调pH至8. 0，加水定容至100 mL。在121°C条件下灭菌20 min。 Tris- HC1溶液(1 mol/L，PH 8. 0):称取121. 1 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800 mL水中， 用浓盐酸调pH至8. 0,加水定容至1 000 mL。在121°C条件下灭菌20 min。 5.4 TE 缓冲液(pH 8. 0):分别加人 Tris- HCKpH 8. 0)10 mL 和 EDTA(pH 8. 0)溶液 2 mL，加水定 容至1 000 mL。在121°C条件下灭菌20 min。 5 Tris - HC1(1 mol/L，pH 7. 5)溶液:称取121. 1 g Tris碱溶解于800 mL水中，用浓盐酸调pH至 5,用水定容至1 000 mL。在121°C条件下灭菌20 min。 5. 6氯仿：异戊醇溶液:将氯仿和异戊醇按照24 : 1的体积比混合。 5.7 CTAB裂解液（1 000 mL):在600 mL水中加人81. 7 g氯化钠，20 g十六烷基H甲基溴化铵 (CTAB)，20 g聚乙烯吡咯烷酮(K30)(PVP)，1 g DIECA，充分溶解(需加热助溶），然后加入Tris - HC1 (pH 7. 5)100 mL，EDTA(pH 8. 0)4 mL,加水定容至1 000 mL，室温保存，使用时加入0. 2